I. U. B.: 2.7.7.7
C. a. S.: 9012-90-2
Enzymatické Reakce: (snímky se otevřou v novém okně)

• Polymerace
• Korektury
• Nátěr Odstranění

DNA polymeráza jsem se účastní replikace DNA prokaryot. Růst řetězce DNA je ve směru 5 ‚až 3‘ s přídavkem na 3 ‚ hydroxylovém konci. Nový řetěz je základna spárována s šablonou, a nový řetěz a šablona jsou antiparalelní. DNA polymeráza I je nejhojnější polymeráza a slouží k vyplnění mezer v DNA, které vznikají během replikace, opravy a rekombinace DNA.

historie:

DNA polymeráza byl jsem objeven Arthurem Kornbergem a kol. v roce 1956. Jeho první výsledky byly poprvé prezentovány v roce 1956 výroční zasedání Federace Amerických Společností pro Experimentální Biologii (FASEB) v Atlantic City, New Jersey. Recenzenti jeho původního příspěvku navrhli, aby autoři odkazovali na produkt spíše jako na „polydeoxyribonukleotid“ než na „DNA“; „DNA“ byla schválena až po odvolání šéfredaktora Johna Edsalla (Friedberg 2006). Další dva dokumenty byly publikovány v roce 1958 Lehman et al. a Bessman et al., který definitivně stanovil DNA polymerázu provádějící replikaci DNA. Kornberg získal Nobelovu cenu v roce 1959 za objev DNA polymerázy i.

v roce 1969, Jovin et al. objasnil složení aminokyselin (Jovin et al. 1969a, b). Téhož roku, DeLucia a Cairns izolovali e. kmen coli s mutací, která ovlivnila DNA polymerázu a překvapivě zjistila, že mutant syntetizoval DNA normálně. Tento objev zpochybnil roli DNA polymerázy v replikaci a vedl skupiny k hledání dalších replikačních enzymů. Současně Klenow a jeho kolegové ukázali, že léčba DNA polymerázy proteolytickým enzymem subtilisin (Typ Carlsberg) vedla ke zvýšení aktivity polymerázy a snížení aktivity exonukleázy. Výsledná DNA polymeráza byla izolována a byl jmenován „Klenowův fragment“ (Klenowův a Henningsen 1970a, a Klenowův a Overgaard-Hansen 1970).

V roce 1970, DNA polymerázy II E. coli byl izolován a charakterizován Arthur Kornberg syn, Thomas Kornberg (Kornberg a Gefter 1970). DNA polymeráza II byla také nezávisle hlášena Knippersem a Mosesem a Richardsonem v roce 1970 (Moses and Richardson 1970b). O rok později Thomas Kornberg a Gefter identifikovali DNA polymerázu III (Kornberg a Gefter 1971).

nedávná práce s DNA polymerázou i zahrnovala zkoumání molekulárního základu substrátové specificity prostřednictvím termodynamických studií (Wowor et al . 2010) a experimenty s JEDNOMOLEKULOVÝMI pražci (Santoso et al. 2010). Hastings a kol. zkoumali interakce pěti DNA polymeráz E. coli během buněčného stresu (Hastings et al . 2010), a Kukreti et al.cílem studií bylo určit, která rezidua jsou důležitá pro 3′-5′ exonukleázovou aktivitu (Kukreti et al . 2008).

specificita:

syntéza DNA vyžaduje primer vlákno s volným 3′-hydroxylovými konci žíhaný na templátu DNA strand a deoxynucleotide trifosforečnanů tvoří základní dvojici s šablony. Přídavek je ve směru 5 ‚až 3‘ s uvolňováním pyrofosfátu. Enzym je aktivní s DNA obsahujícími jednovláknové mezery a také s DNA s jednovláknovými zlomy nebo zářezy. Za určitých podmínek mohou RNA-DNA hybridy a duplex RNA sloužit jako template-primer (Setlow 1972).

5′ k 3′ exonuclease činnosti spojené s DNA polymerázová jsem degraduje oba single a double stranded DNA 5′ 3′ směr, dávat 5′-mononucleotides. Aktivita 5′ až 3 ‚exonukleázy je specifická pro dvouvláknovou DNA, čímž se získá 5‘ – mononukleotidy a oligonukleotidy. DNA polymeráza I může také vyloučit neodpovídající oblasti v DNA (Setlow 1972).

podobnou strukturu DNA polymerázy uvedla, že většina DNA polymerázy, enzymy použít dva identické kovové ion-polymeráza katalyzuje mechanismus. Jeden kovový ion aktivuje 3 ‚ – OH primeru pro útok na a-fosfát dNTP. Druhý kovový ion stabilizuje záporný náboj odcházejícího kyslíku a chelatuje B-A G-fosfáty (Steitz 1999).

Klenowův fragment je proteolytický produkt E. coli DNA polymerázy I, který si zachovává polymerace a 3′ k 5′ exonuclease činnost, ale ztratil 5′ k 3′ exonuclease činnosti.

Složení:

DNA polymeráza I je převládající vyvolá enzym nacházející se v E. coli. Obsahuje jednu disulfidovou vazbu a jednu sulfhydrylovou skupinu (Jovin et al. 1969b). Pět různých DNA polymeráz byly izolovány z E. coli a byly označeny I, II, III, IV, a V. DNA polymeráza I funkce vyplnit DNA mezery, které vznikají během DNA replikace, opravy a rekombinace. DNA polymeráza II také funguje při editaci a korektuře hlavně v zaostávajícím řetězci (Kim et al . 1997, Wagner a Nohmi 2000). DNA polymeráza III je hlavním replikačním enzymem. DNA polymeráza IV A V mají velká aktivní místa, která umožňují větší misincorporaci bází, a jsou proto náchylnější k chybám. Chybí jim také korektury-exonukleázové podjednotky k nápravě chybných záznamů (Nohmi 2006, and Hastings et al. 2010). DNA polymeráza V je přítomna na významných úrovních pouze v buňkách indukovaných SOS a nadměrná exprese omezuje syntézu DNA (Marsh and Walker 1985).

tvar domény všech polymeráz, jejichž struktury jsou známy, byl popsán jako“ pravá ruka „s doménami“ palec“,“ dlaň „a“ prst “ (Kohlstaedt et al. 1992). Palm regionu je, že katalyzují přenos fosforylové, a prst regionu je myšlenka komunikovat s příchozí skupinou trifosfát a šablony, základna je v kombinaci. Předpokládá se, že palec pomáhá při určování polohy DNA a translokaci (Brautigam and Steitz 1998).

Molekulární Charakteristiky:

gen kódující DNA polymeráza I (polA) obsahuje cca 3 000 párů bazí a kóduje přibližně 1000 aminokyselinových zbytků v jednoduchý polypeptidový řetězec. Dokonce i organismy oddělené miliardou let evoluce (jako Deinococcus-Thermus rody a e. coli) mají přibližně 35% aminokyselinovou identitu a přibližně 50% homologii (Patel et al . 2001).

přístupové číslo proteinu: P00582

molekulová hmotnost:

• 109 kDa (Jovin et al . 1969a, b)
• Klenowův fragment: 70 kDa (gelová filtrace, Klenowův a Overgaard-Hansen 1970)

Optimální pH:

• Maximální aktivity je dosaženo při pH 7.4 s draselného fosfátového pufru pro nativní DNA nebo poly dAT šablony-nátěr systémy (Richardson et al. 1964)
• Klenowův fragment: maximální aktivity se získají při 7,4 s fosfátovým pufrem a při 8.4 s Tris-HCl pufru

Izoelektrický Bod:

• 5.40 (Teoretické)

Extinkční Koeficient:

Aktivátory:

• dvojmocný kation je nutné pro činnost
• Mg2+ v koncentraci 7 mM výnosy optimální činnost podle podmínek standardní test (Richardson et al. 1964)
• Mn2+ může částečně splnit kovových iontů požadavek
• aktivita Enzymu je také ovlivněna koncentrací monovalentní kationty jako jsou K+, Rb+, Cs+, NH4+

Inhibitory:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Vysoké procento začlenění radioaktivity pro nick překlad testy
• Standardní referenční materiál pro studie DNA polymerázy
• Výroba střídavého kopolymerů, jako jsou poly d(V) a homopolymery, jako jsou poly dG-poly dC
• Klenowův fragment: DNA sekvenování (Sanger et al. 1977), fill-in 5′ převisy a odstranění 3′ přesahy do formuláře tupými konci (Sambrook 1989), a druhý pramen syntézy v mutageneze (Gubler 1987)