Taq polymerázy je jedním z nejvíce všudypřítomné enzymy v molekulární biologii. Od svého objevu v 19651, Taq se staly páteří PCR a všech navazujících aplikací, které technologie umožňuje. Tato silná polymeráza je výchozí volbou pro většinu postupů amplifikace a klonování, stejně jako diagnostické testy, sekvenování DNA markerových genů a mnoho dalšího.

Co dělá Taq polymerázu tak zvláštní? V dnešním článku se podíváme na výhody a nevýhody Taq, co potřebujete, aby si nejlepších výsledků PCR z Taq polymerázy, a některé Taq deriváty, které mohou pomoci vám dosáhnout lepších výsledků pro specializované aplikace.

proč je Taq tak široce používán pro PCR?

Popularita Taq těží ze skutečnosti, že se jednalo o první vysokoteplotní polymerázu objevenou molekulárními Biology. Ale to není zdaleka jediný důvod, proč je dnes stále tak vysoká poptávka.

Taq polymeráza má důležitou vlastnost, že je stabilní při teplotách do 95°C2. To je kritické, protože to je teplota, při které dna denaturuje-požadovaný krok na začátku PCR reakce. Zatímco středně-teplotní polymeráza by také denaturovat při této teplotě, které je činí k ničemu, Taq zůstává dokonale připraveni začít polymerizační váš cílový vzorek DNA.

kromě toho má Taq tu výhodu, že je nejaktivnější v teplotním rozmezí 70-80°C2. To je dost horké, že DNA nebude znovu, ale primery, které žíhaly při nižších teplotách, se také neodlupují. Taq polymeráza tedy funguje velmi dobře při teplotách, které většina standardních PCR reakcí vyžaduje.

konečně, Taq vyhovuje základním potřebám molekulární biologie velmi dobře. Polymeráza opouští produkty A-tailed, které lze snadno klonovat do vektoru pomocí standardní klonovací sady TA. Taq je také relativně odolný vůči sekvencím DNA se širokým rozsahem obsahu GC a není tak vybíravý ohledně cílových koncentrací DNA nebo dNTP.

co Taq potřebuje k účinné polymeraci?

Pokud jednoduše přidáte Taq polymerázu do vzorku DNA, nic moc by se nestalo. Je to proto, že stejně jako většina enzymů potřebuje Taq speciální směs činidel, aby správně fungovala.

základní Taq pufr zahrnuje chlorid draselný, Tris hydrochlorid a Triton X-100. Tyto chemikálie jsou méně důležité pro optimalizaci vašich PCR reakcí než pro udržení Taq v bezpečí během skladování v mrazničce – což je samo o sobě důležité pro co nejlepší využití vašich PCR. Zatímco si můžete vytvořit svůj vlastní vyrovnávací paměti k rehydrataci a obchodu lyofilizovaný enzym Taq, drtivá většina polymeráza je prodáván jako master mix s Taq již pozastaveno v požadované vyrovnávací paměti řešení.

kritičtější pro vaše PCR reakce je chlorid hořečnatý. Hořčík je nezbytným kofaktorem pro polymeru Taq3. Bez ní nebude Taq schopen katalyzovat přidání nukleotidů k primeru nebo rostoucímu řetězci DNA. Koncentrace hořčíku také záleží. Jak se k PCR reakci přidává více hořčíku, Taq se stává aktivnějším, ale také méně specifickým při polymeraci pouze cílového řetězce DNA.

vzhledem k úloze hořčíku závislé na koncentraci můžete najít směsi Taq master s hořčíkem, které jsou již součástí,a také směsi, které jej vynechávají. V druhém případě budete muset přidat chlorid hořečnatý samostatně (což vyžaduje další pipetovací krok při přípravě PCR). Výhodou je, že můžete řídit přesnou koncentraci hořčíku, takže můžete experimentovat a najít nejoptimálnější směs produktivity a specifičnosti Taq.

jaké jsou problémy s Taq polymerázou?

Taq je široce používán pro rutinní PCR, ale bohužel není ideální pro všechny aplikace. Nejpozoruhodnější nevýhodou Taq je, že to není nejpřesnější polymeráza. Taq má chybovost kolem jedné chyby na 100 000 základních párů4. Pro srovnání, PFU korektura polymerázy je asi 10 krát přesnější. Pokud používáte PCR před klonováním nebo sekvenováním DNA, může být tento rozdíl v chybovosti velmi významný.

standardní Taq polymeráza může mít také problémy s amplifikací cílových DNA sekvencí delších než asi 1 kB. Ve srovnání s jinými typy polymeráz má Taq nízkou procesivitu, což znamená, že jeho účinnost výrazně klesá s délkou amplikonu. Tato nízká procesivita může být zhoršena přítomností inhibitorů PCR, které jsou běžné, pokud pracujete s DNA extrahovanou z tkání, rostlin nebo půdy.

a Konečně, když Taq polymerázy je nejúčinnější při teplotách nad 70°C, enzym pokračuje v práci v teplotách nižších než 50°C. to je problematické, protože Taq může samovolně polymerovat primery nebo non-cílové sekvence DNA, když teplota ve vaší PCR reakce spadá aby primery žíhání k cílové sekvenci. V důsledku toho je známo, že Taq vyrábí dimery primerů a další nežádoucí produkty, které se mohou dostat do cesty následným aplikacím, jako je klonování.

Specializované Taq Polymerázy pro Pokročilé Aplikace

Naštěstí, tam jsou specializované formy Taq polymerázy, že řešení některých z těchto problémů. Například highQu ALLin Taq polymeráza je syntetická verze Taq, která má větší procesivitu než standardní Taq. Výsledkem je, že můžete snadněji dosáhnout výtěžků amplikonu z šablon s vysokým GC, šablon delších než 1 kB a vzorků se střední koncentrací inhibitorů.

další běžná forma Taq, jako je Allin Hot Start Taq, je navržena s molekulárním inhibitorem, aby byla neaktivní při nižších teplotách. Hot start Taq je funkční pouze po zahřátí na 95°C. To výrazně snižuje tvorbu primer dimerů a nespecifické amplikony v důsledku polymerizace před začátkem PCR reakce. Výsledkem je, že při práci s delšími cílovými sekvencemi můžete získat vyšší výnosy a snížit amplikony pozadí, které obvykle vyžadují vyčištění.

závěr

Taq polymeráza je již dlouho enzymem volby pro rutinní i komplexní PCR aplikace. Dokonale vyhovuje požadavkům reakce PCR a zároveň usnadňuje následné aplikace, jako je klonování a sekvenování. Ačkoli standardní Taq má některé nevýhody, ty jsou do značné míry řešeny pomocí inženýrství nebo hot start Taq polymerázy. Pro drtivou většinu aplikací zůstává Taq polymeráza enzymem go-to pro molekulární Biology.

1 Ishino S, Ishino y.2014. Hranice v mikrobiologii 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostická molekulární patologie: průvodce aplikovaným molekulárním testováním.

3 Williams m.2018. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molekulární Biologie Mezinárodní 287430.