Taq-Polymerase ist eines der am weitesten verbreiteten Enzyme in der Molekularbiologie. Seit seiner Entdeckung im Jahr 19651 ist Taq zum Rückgrat der PCR und aller nachgelagerten Anwendungen geworden, die die Technologie ermöglicht. Diese leistungsstarke Polymerase ist die Standardauswahl für die meisten Amplifikations- und Klonierungsverfahren sowie für diagnostische Tests, Marker-Gen-DNA-Sequenzierung und vieles mehr.

Was macht die Taq-Polymerase so besonders? Im heutigen Artikel werfen wir einen Blick auf die Vor- und Nachteile von Taq, was Sie benötigen, um die besten PCR-Ergebnisse aus Taq-Polymerase zu erhalten, und einige Taq-Derivate, mit denen Sie bessere Ergebnisse für spezielle Anwendungen erzielen können.

Warum wird Taq so häufig für die PCR verwendet?

Die Popularität von Taq profitiert von der Tatsache, dass es die erste Hochtemperatur-Polymerase war, die von Molekularbiologen entdeckt wurde. Aber das ist bei weitem nicht der einzige Grund, warum es heute noch so gefragt ist.

Taq-Polymerase hat die wichtige Eigenschaft, bei Temperaturen bis zu 95 ° C2 stabil zu sein. Das ist kritisch, weil dies die Temperatur ist, bei der DNA denaturiert – ein notwendiger Schritt zu Beginn der PCR-Reaktion. Während jede moderate Temperaturpolymerase auch bei dieser Temperatur denaturieren würde, was sie unbrauchbar macht, bleibt Taq perfekt bereit, mit der Polymerisation Ihrer Ziel-DNA-Probe zu beginnen.

Darüber hinaus hat Taq den Vorteil, dass es im Temperaturbereich von 70-80 °C am aktivsten ist2. Das ist heiß genug, dass die DNA nicht erneut reibt, aber Primer, die bei niedrigeren Temperaturen geglüht sind, werden sich auch nicht ablösen. Daher funktioniert die Taq-Polymerase bei den Temperaturen, die die meisten Standard-PCR-Reaktionen erfordern, äußerst gut.

Schließlich passt Taq sehr gut zu den molekularbiologischen Grundbedürfnissen. Die Polymerase hinterlässt A-Tailed-Produkte, die mit einem Standard-TA-Klonierungskit leicht in einen Vektor kloniert werden können. Taq ist auch relativ widerstandsfähig gegen DNA-Sequenzen mit einem breiten Spektrum von GC-Gehalten und ist nicht so wählerisch in Bezug auf Ziel-DNA- oder dNTP-Konzentrationen.

Was braucht Taq, um effektiv zu polymerisieren?

Wenn Sie einfach Taq-Polymerase allein zu einer DNA-Probe hinzufügen würden, würde nicht viel passieren. Das liegt daran, dass Taq wie die meisten Enzyme eine spezielle Mischung von Reagenzien benötigt, um richtig zu funktionieren.

Der grundlegende Taq-Puffer enthält Kaliumchlorid, Tris-Hydrochlorid und Triton X-100. Diese Chemikalien sind weniger relevant für die Optimierung Ihrer PCR-Reaktionen als für die Sicherheit von Taq während der Lagerung im Gefrierschrank – was selbst wichtig ist, um das Beste aus Ihren PCRs herauszuholen. Während Sie Ihren eigenen Puffer herstellen können, um lyophilisiertes Taq-Enzym zu rehydrieren und zu lagern, wird die überwiegende Mehrheit der Polymerase als Mastermix verkauft, wobei Taq bereits in der erforderlichen Pufferlösung suspendiert ist.

Wichtiger für Ihre PCR-Reaktionen ist Magnesiumchlorid. Magnesium ist ein essentieller Cofaktor für die Taq-Polymerase3. Ohne sie ist Taq nicht in der Lage, die Zugabe von Nukleotiden zum Primer oder zum wachsenden DNA-Strang zu katalysieren. Die Konzentration von Magnesium spielt ebenfalls eine Rolle. Wenn mehr Magnesium zu einer PCR-Reaktion hinzugefügt wird, wird Taq aktiver, aber auch weniger spezifisch bei der Polymerisation nur Ihres Ziel-DNA-Strangs.

Aufgrund der konzentrationsabhängigen Rolle von Magnesium finden Sie Taq Master-Mischungen mit bereits enthaltenem Magnesium sowie Mischungen, die es weglassen. Im letzteren Fall müssen Sie Magnesiumchlorid separat hinzufügen (was bei der Vorbereitung Ihrer PCRs einen zusätzlichen Pipettierschritt erfordert). Der Vorteil ist, dass Sie die genaue Konzentration von Magnesium kontrollieren können, so dass Sie experimentieren können, um die optimale Mischung aus Taq-Produktivität und Spezifität zu finden.

Was sind die Probleme mit der Taq-Polymerase?

Taq wird häufig für Routine-PCRs verwendet, ist aber leider nicht für alle Anwendungen perfekt. Der bemerkenswerteste Nachteil von Taq ist, dass es nicht die genaueste Polymerase ist. Taq hat eine Fehlerrate von etwa einem Fehler pro 100.000 Basispaare4. Im Vergleich dazu ist die Pfu-Korrekturlesepolymerase etwa 10-mal genauer. Wenn Sie PCR vor dem Klonen oder der DNA-Sequenzierung verwenden, kann dieser Unterschied in der Fehlerrate sehr signifikant sein.

Standard-Taq-Polymerase kann auch Probleme mit der Amplifikation von Ziel-DNA-Sequenzen haben, die länger als etwa 1 kB sind. Im Vergleich zu anderen Arten von Polymerasen hat Taq eine geringe Prozessivität, was bedeutet, dass seine Effizienz mit der Länge Ihres Amplikons signifikant abnimmt. Diese geringe Prozessivität kann durch das Vorhandensein von PCR-Inhibitoren verschlimmert werden, die häufig auftreten, wenn Sie mit DNA arbeiten, die aus Geweben, Pflanzen oder Böden extrahiert wurde.Während die Taq-Polymerase bei Temperaturen über 70 ° C am effizientesten ist, arbeitet das Enzym bei Temperaturen unter 50 ° C. Das ist problematisch, da Taq unbeabsichtigt Primer oder Nicht-Ziel-DNA-Sequenzen polymerisieren kann, wenn die Temperatur in Ihrer PCR-Reaktion sinkt, damit Primer an Ihre Zielsequenz tempern können. Infolgedessen ist bekannt, dass Taq Primer-Dimere und andere unerwünschte Produkte produziert, die nachgelagerten Anwendungen wie dem Klonen im Wege stehen können.

Spezialisierte Taq-Polymerasen für fortgeschrittene Anwendungen

Glücklicherweise gibt es spezielle Formen von Taq-Polymerase, die einige dieser Probleme lösen. Zum Beispiel ist highQu ALLin Taq Polymerase eine synthetische Version von Taq, die mehr Prozessivität als Standard-Taq hat. Als Ergebnis können Sie leichter Amplikonausbeuten aus High-GC-Templates, Templates mit einer Länge von mehr als 1 kB und Proben mit moderaten Konzentrationen von Inhibitoren erzielen.

Eine andere übliche Form von Taq, wie die ALLin Hot Start Taq, ist mit einem molekularen Inhibitor ausgestattet, um sie bei niedrigeren Temperaturen inaktiv zu machen. Hot Start Taq ist erst nach dem Erhitzen auf 95 °C funktionsfähig, was die Bildung von Primer-Dimeren und unspezifischen Amplikons als Folge der Polymerisation vor dem Start Ihrer PCR-Reaktionen drastisch reduziert. Infolgedessen können Sie höhere Erträge erzielen, wenn Sie mit längeren Zielsequenzen arbeiten, und Hintergrundamplikons reduzieren, die normalerweise bereinigt werden müssen.

Fazit

Taq-Polymerase ist seit langem das Enzym der Wahl für Routine- und komplexe PCR-Anwendungen. Es passt perfekt zu den Anforderungen der PCR-Reaktion und vereinfacht gleichzeitig nachgelagerte Anwendungen wie Klonierung und Sequenzierung. Obwohl Standard-Taq einige Nachteile aufweist, werden diese weitgehend durch die Verwendung einer technischen oder Heißstart-Taq-Polymerase gelöst. Für die überwiegende Mehrheit der Anwendungen bleibt die Taq-Polymerase das Enzym für Molekularbiologen.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Grenzen in der Mikrobiologie 5:465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostische molekulare Pathologie: Ein Leitfaden für angewandte molekulare Tests.

3. März 2018. Wissenschaft

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molekularbiologie International 287430.