I.U.B.: 2.7.7.7
C.A.S.: 9012-90-2
Enzymatische Reaktionen: (Die Bilder werden in einem neuen Fenster geöffnet)

• Polymerisation
• Korrekturlesen
• Primerentfernung

DNA Polymerase I ist an der DNA-Replikation prokaryoten. Das DNA-Kettenwachstum erfolgt in 5′- bis 3′-Richtung mit Addition am 3′-Hydroxylende. Die neue Kette ist basispaarig mit der Schablone, und die neue Kette und die Schablone sind antiparallel. DNA-Polymerase I ist die am häufigsten vorkommende Polymerase und füllt Lücken in der DNA, die während der DNA-Replikation, -reparatur und -rekombination entstehen.

Geschichte:

Die DNA-Polymerase I wurde von Arthur Kornberg et al. im Jahr 1956. Seine ersten Ergebnisse wurden erstmals 1956 auf der Jahrestagung der Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) in Atlantic City, New Jersey, vorgestellt. Rezensenten seiner ersten Arbeit vorgeschlagen, dass die Autoren auf das Produkt als ‚Polydeoxyribonukleotid‘ beziehen, anstatt ‚DNA‘; ‚DNA‘ wurde erst nach einem Appell an den Chefredakteur John Edsall (Friedberg 2006) genehmigt. Zwei weitere Arbeiten wurden 1958 von Lehman et al. und Bessman et al., die DNA-Polymerase definitiv herstellte, führte DNA-Replikation durch. Kornberg erhielt 1959 den Nobelpreis für seine Entdeckung der DNA-Polymerase I.

1969 haben Jovin et al. klärte die Aminosäurezusammensetzung auf (Jovin et al. 1969a, b). Das selbe Jahr, DeLucia und Cairns isolierten ein E. coli-Stamm mit einer Mutation, die die DNA-Polymerase beeinflusste und überraschenderweise feststellte, dass die Mutante DNA normal synthetisierte. Diese Entdeckung warf Zweifel an der Rolle der DNA-Polymerase bei der Replikation auf und veranlasste Gruppen, nach anderen Replikationsenzymen zu suchen. Gleichzeitig zeigten Klenow und Kollegen, dass die Behandlung der DNA-Polymerase mit dem proteolytischen Enzym Subtilisin (Typ Carlsberg) zu einer Erhöhung der Polymeraseaktivität und einer Abnahme der Exonukleaseaktivität führte. Die resultierende DNA-Polymerase wurde isoliert und als „Klenow-Fragment“ bezeichnet (Klenow und Henningsen 1970a und Klenow und Overgaard-Hansen 1970).

1970 wurde die DNA-Polymerase II von E. coli von Arthur Kornbergs Sohn Thomas Kornberg isoliert und charakterisiert (Kornberg und Gefter 1970). DNA-Polymerase II wurde auch unabhängig von Knippers und von Moses und Richardson im Jahr 1970 berichtet (Moses und Richardson 1970b). Ein Jahr später identifizierten Thomas Kornberg und Gefter die DNA-Polymerase III (Kornberg und Gefter 1971).

Jüngste Arbeiten mit DNA-Polymerase I beinhalteten die Untersuchung der molekularen Grundlagen der Substratspezifität durch thermodynamische Studien (Wowor et al. 2010) und Einzelmolekül-FRET-Experimenten (Santoso et al. 2010). Hastings et al. haben die Wechselwirkungen der fünf E. coli DNA-Polymerasen während zellulärem Stress untersucht (Hastings et al. 2010) und Kukreti et al.’s Studien zielten darauf ab, zu bestimmen, welche Reste für die 3′-5′-Exonukleaseaktivität wichtig sind (Kukreti et al. 2008).

Spezifität:Die DNA-Synthese erfordert einen Primerstrang mit einem freien 3′-Hydroxylterminus, der an einen DNA-Template-Strang getempert ist, und die Desoxynukleotidtriphosphate bilden Basenpaare mit dem Template. Die Addition erfolgt in 5′ bis 3′ Richtung unter Freisetzung von Pyrophosphat. Das Enzym ist aktiv mit DNAs, die einzelsträngige Lücken enthalten, sowie mit DNAs mit einzelsträngigen Brüchen oder Kerben. Unter bestimmten Bedingungen können RNA-DNA-Hybride und ein RNA-Duplex als Template-Primer dienen (Setlow 1972).

Die mit der DNA-Polymerase I assoziierte 5′- bis 3′-Exonuklease-Aktivität baut sowohl einzel- als auch doppelsträngige DNA in 5′- bis 3′-Richtung ab und liefert 5′-Mononukleotide. Die 5′- bis 3′-Exonuklease-Aktivität ist spezifisch für doppelsträngige DNA und liefert 5′-Mononukleotide und Oligonukleotide. DNA-Polymerase I kann auch nicht übereinstimmende Regionen in DNA herausschneiden (Setlow 1972).Die ähnliche Struktur von DNA-Polymerasen hat gezeigt, dass die meisten DNA-Polymerase-Enzyme einen identischen Zwei-Metall-Ionen-katalysierten Polymerase-Mechanismus verwenden. Ein Metallion aktiviert das 3′-OH des Primers zum Angriff auf das a-Phosphat des dNTP. Das andere Metallion stabilisiert die negative Ladung des austretenden Sauerstoffs und cheliert die b- und g-Phosphate (Steitz 1999).

Das Klenow-Fragment ist ein proteolytisches Produkt der E. coli-DNA-Polymerase I, das Polymerisation und 3’bis 5′ Exonuklease-Aktivität beibehält, aber 5′ bis 3′ Exonuklease-Aktivität verloren hat.

Zusammensetzung:

DNA-Polymerase I ist das vorherrschende polymerisierende Enzym in E. coli. Es enthält eine einzelne Disulfidbindung und eine Sulfhydrylgruppe (Jovin et al. 1969b). Aus E. coli wurden fünf verschiedene DNA-Polymerasen isoliert, die als I, II, III, IV und V bezeichnet wurden. DNA-Polymerase II funktioniert auch beim Editieren und Korrekturlesen hauptsächlich im nachlaufenden Strang (Kim et al. 1997, Wagner und Nohmi 2000). DNA-Polymerase III ist das wichtigste replikative Enzym. Die DNA-Polymerase IV und V haben große aktive Stellen, die eine stärkere Baseninkorporation ermöglichen, und sind daher fehleranfälliger. Ihnen fehlen auch Korrekturlesen-Exonuklease-Untereinheiten, um Fehlinkorporationen zu korrigieren (Nohmi 2006 und Hastings et al. 2010). DNA-Polymerase V ist nur in SOS-induzierten Zellen in signifikanten Mengen vorhanden und Überexpression schränkt die DNA-Synthese ein (Marsh und Walker 1985).

Die Domänenform aller Polymerasen, deren Strukturen bekannt sind, wurde als „rechte Hand“ mit „Daumen“-, „Handfläche“- und „Finger“ -Domänen beschrieben (Kohlstaedt et al. 1992). Es wird angenommen, dass die Handflächenregion den Phosphoryltransfer katalysiert, und es wird angenommen, dass die Fingerregion mit dem ankommenden Nukleosidtriphosphat und der Templat-Base, mit der es gepaart ist, interagiert. Es wird angenommen, dass der Daumen bei der Positionierung der DNA und bei der Translokation hilft (Brautigam und Steitz 1998).

Molekulare Eigenschaften:

Das Gen, das für DNA-Polymerase I (polA) kodiert, enthält ungefähr 3.000 Basenpaare und kodiert ungefähr 1.000 Aminosäurereste in einer einfachen Polypeptidkette. Sogar Organismen, die durch eine Milliarde Jahre Evolution getrennt sind (wie Deinococcus-Thermus-Gattungen und E. coli) weisen etwa 35% Aminosäureidentität und etwa 50% Homologie auf (Patel et al. 2001).

Proteinzugangsnummer: P00582

Molekulargewicht:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Klenow-Fragment: 70 kDa (Gelfiltration, Klenow und Overgaard-Hansen 1970)

Optimaler pH-Wert:

• Maximale Aktivität wird bei pH 7,4 mit Kaliumphosphatpuffer für native DNA oder Poly dAT Template-Primer-Systeme (Richardson et al. 1964)
• Klenow-Fragment: Maximale Aktivitäten werden bei 7,4 mit Phosphatpuffer und bei 8 erhalten.4 mit Tris-HCl-Puffer

Isoelektrischer Punkt:

• 5,40 (Theoretisch)

Extinktionskoeffizient:

Aktivatoren:

• Für die Aktivität wird ein zweiwertiges Kation benötigt
• Mg2+ ergibt bei einer Konzentration von 7 mM optimale Aktivität unter den Bedingungen des Standard-Assays (Richardson et al. 1964)
• Mn2+ kann den Metallionenbedarf teilweise erfüllen
• Die Enzymaktivität wird auch durch Konzentrationen einwertiger Kationen wie K+, Rb+, Cs+ und NH4+ beeinflusst

Inhibitoren:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Hochprozentiger Einbau von Radioaktivität für nick-Translations-Assays
• Standardreferenzmaterial für die Untersuchung von DNA-Polymerasen
• Herstellung alternierender Copolymere wie Poly d(A-T) und Homopolymere wie Poly dG-poly dC
• Klenow fragment: DNA sequencing (Sanger et al. 1977), Auffüllen von 5′-Überhängen und Entfernen von 3′-Überhängen zu stumpfen Enden (Sambrook 1989) und Zweitstrangsynthese in der Mutagenese (Gubler 1987)