Editorial zum Forschungsthema

Epitope Discovery and Synthetic Vaccine Design

Traditionelle und Impfstoffe der ersten Generation bestehen aus lebenden oder fixierten ganzen Pathogenen, während Impfstoffe der zweiten Generation unter anderem die nativen Proteinantigene enthalten, die vom Pathogen gereinigt wurden. Darüber hinaus bestehen Impfstoffe der dritten Generation aus DNA-Plasmiden, die in der Lage sind, die Sequenz der wichtigsten Pathogenproteinantigene im Wirt zu exprimieren. Während dieser Entwicklung von Impfstoffen gab es jedoch einen Sicherheitsgewinn mit einem Wirksamkeitsverlust, der durch die Verwendung von Adjuvantien kompensiert wurde.

Der neueste Schritt in der Entwicklung von Impfstoffformulierungen ist die Entwicklung von Epitop-Impfstoffen. Epitope sind kurze Aminosäuresequenzen eines Proteins, die eine direktere und stärkere Immunantwort induzieren können als die Reaktion, die durch das gesamte verwandte Protein induziert wird (1).Darüber hinaus erfordert die Strategie zur Entwicklung von Epitop-Impfstoffen eine genaue Kenntnis der Aminosäuresequenz des immunogenen Proteins von Interesse. Da Impfstoffe gegen Parasiten-, Bakterien- oder Virusinfektionen und Tumoren eine zelluläre Immunantwort zur Vorbeugung, Kontrolle und Heilung erfordern, wurde eine Strategie namens Reverse Vaccinology (RV) entwickelt. Der RV-Ansatz verwendet die Informationen der in der DNA des Pathogens enthaltenen Codonsequenz, um eine komplementäre cDNA zu erhalten, und übersetzt sie weiter, um die Sequenz des Proteins von Interesse zu erhalten. Sobald sich diese Proteine in den Antigen-präsentierenden Zellen (APC) des Wirts befinden, werden sie verarbeitet. Die T-Zell-Epitope werden dann proteolytisch vom Protein abgespalten und durch die MHC-Moleküle der APC-Oberfläche weiter exponiert, um mit den Rezeptoren von T-Zellen zu interagieren. Daher können mit der Kenntnis der Primärsequenz des Proteinantigens die Epitope identifiziert werden, indem die Domänen oder kleineren Peptide des Proteins separat kloniert und experimentell bestimmt werden, welche immunogener ist, oder alternativ durch Screening der gesamten Proteinsequenz unter Verwendung von In-Silico-Screening-Programmen .

Die Struktur der MHC-Moleküle Auf APC haben MHC-Klasse-I-Moleküle eine einzelne Alpha-Kette, die die Bindung beeinflusst, und die Bindungsrille liegt zwischen den Alpha 1- und Alpha 2-Domänen (Fleri et al.). Da die Bindungsrille geschlossen ist, kann sie nur kürzere Peptide (8-14 Aminosäuren) aufnehmen. Der Rillenbindungskern hat nur neun Aminosäuren. Im Gegensatz dazu haben MHC-Klasse-II-Moleküle zwei Ketten, Alpha und Beta, die die Bindung beeinflussen. Die Bindungsnut ist offen und kann längere Peptide (13-25 Aminosäuren) aufnehmen, aber der Bindungskern hat 9 Aminosäurereste mit 0-5 Resten, die auf jeder Seite flankieren. Nur die Alpha-Kette ist in Molekülen der Klasse I variabel, daher lautet die Nomenklatur „HLA“, gefolgt vom Locus A, B oder C, einem Sternchen und der Nummer des Allels, das sie darstellt. Bei Molekülen der Klasse II wirken sich sowohl die Alpha- als auch die Betakette auf die Bindung aus, und beide Ketten sind für die DP- und DQ-Loci variabel. Für den DR-Locus ist jedoch nur die Beta-Kette variabel (Fleri et al.). Für alle genannten Eigenschaften ist die MHC-Klasse-II-Bindungsvorhersage schwieriger als die für Klasse-I-Moleküle. Basierend auf verschiedenen Algorithmen des maschinellen Lernens wurden mehrere Vorhersagen entwickelt, um die T-Zell-Epitope der Proteinantigene zu identifizieren .Im Gegensatz dazu ist das Problem bei Parasiten, viralen, bakteriellen Infektionen und Tumoren, deren Prävention, Kontrolle und Heilung die Entwicklung einer starken Antikörperantwort erfordert, komplexer. Tatsächlich sind die meisten B-Zell-Epitope diskontinuierliche Epitope, die aus Aminosäureresten bestehen, die sich auf separaten Regionen des Proteins befinden und durch die Faltung der Kette miteinander verbunden sind (4). Diese Gruppen von Resten können nicht als solche aus dem Antigen isoliert werden. Daher wird die für diese Fälle verwendete Strategie als strukturbasierte reverse Vaccinologie (SBRV) bezeichnet und konzentriert sich auf die Verwendung monoklonaler Antikörper gegen das Proteinantigen. Es gibt sechs komplementäre bestimmende Regionen (4) oder Antigen-bindende Regionen (ABRs) (5) im Antikörpermolekül, die mit dem Antigen interagieren können. Eine Antigen-Bindungsstelle, auch Paratop genannt, die eine kleine Region (von 10-15 Aminosäuren) ist, ist der Teil des Antikörpers, der ein Antigen erkennt und daran bindet. Jedes ABR unterscheidet sich jedoch signifikant in seiner Aminosäurezusammensetzung und neigt dazu, verschiedene Arten von Aminosäuren auf der Oberfläche von Proteinen zu binden. Trotz dieser Unterschiede erlaubt die kombinierte Präferenz der sechs ABRs keine Unterscheidung der Epitope von der übrigen Proteinoberfläche. Diese Ergebnisse erklären den schlechten Erfolg vergangener und neu vorgeschlagener Methoden zur Vorhersage von Proteinepitopen (4, 5). Die SBVR-Strategie wird verwendet, um die Wechselwirkung des Komplexes aus dem monoklonalen Antikörper mit dem Protein zu untersuchen, um zu identifizieren, an welche Aminosäuren des Antigenproteins das ABR oder Paratop des monoklonalen Antikörpers bindet. Ziel dieses Ansatzes ist es, die potentielle Aminosäuresequenz des diskontinuierlichen Epitops indirekt aufzuklären. Die Suche nach den Epitopen, die mit Antikörpern interagieren, ist jedoch eine viel schwierigere Aufgabe, für die erfolgreiche Vorhersagealgorithmen fast nicht existieren. Folglich hat diese Strategie nicht viel Erfolg erzielt (4, 5).

Die Unfähigkeit synthetischer linearer Peptide, die diskontinuierlichen Epitope effektiv nachzuahmen, ist einer der Gründe für das Versagen vieler synthetischer B-Zell-Impfstoffe, die Synthese neutralisierender Antikörper zu induzieren. Diese Fakten erklären teilweise, warum, obwohl mehr als tausend synthetische B-Zell-Peptide identifiziert wurden, nur 125 von ihnen in die Phase I, 30 von ihnen in die Phase II übergegangen sind und keiner von ihnen in Phase-III-Studien erfolgreich war oder für den menschlichen Gebrauch zugelassen wurde (4).

Während RV sich also allgemein auf die In-silico-Analyse des gesamten Pathogengenoms bezieht, um alle Antigene zu identifizieren, die der Pathogen exprimieren kann, bezieht sich der SBRV auf den Ansatz, der versucht, aus der bekannten kristallographischen Struktur der neutralisierenden Antikörper, die an die Epitope gebunden sind, einen Impfstoff zu erzeugen (6).

Bei Infektionen, die durch eine Antikörperantwort vermeidbar sind, wurde der Begriff Antigenität häufig mit Immunogenität verwechselt (7). Tatsächlich werden die Epitope einiger viraler Antigene oft fälschlicherweise als Immunogene betrachtet, wenn sie nur Antigene sind, da sie mit einer Vielzahl von Antikörpern interagieren können, die gegen ein Virus gezüchtet wurden, aber nicht in der Lage sind, die Synthese der neutralisierenden Antikörper zu induzieren Schutz (7). Bisher wurde angenommen, dass ein antigenes Epitop, wenn es in vitro stark an einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper gebunden ist, auch die Synthese neutralisierender Antikörper induzieren kann, wenn es als Impfstoff verwendet wird. Dies ist jedoch nicht der Fall (7).

Zusätzlich wurden weitere Konzepte in Verbindung mit der RV-Strategie entwickelt (6). Das Konzept von RV 1.0 ist ein Ansatz, der auf Bioinformatik und Tierimmunisierung basiert und verwendet wird, um zu bestimmen, welche Antigene für die Impfung besser geeignet sind (8). Im Gegensatz dazu bezieht sich das Konzept von RV 2.0 auf eine Strategie, die monoklonale Antikörper von den wenigen Individuen erhält, die eine starke Antikörperantwort gegen natürliche Infektionen zeigen. Diese monoklonalen Antikörper leiten das Impfstoffdesign in die Umkehrrichtung des normalen Impfstoffflusses zu Antikörpern (8).

Darüber hinaus wurde das Konzept des „rationalen Impfstoffdesigns“ sehr oft verwendet, um die Erwartung zu wecken, den gleichen Erfolg wie die zuvor verfolgte Strategie des „rationalen Wirkstoffdesigns“ zu haben. Das „rationale Wirkstoffdesign“ hängt jedoch mit der Entwicklung chemischer Analoga zusammen, die perfekte Inhibitoren des aktiven Zentrums wichtiger lebenswichtiger Enzyme des Erregers sind. Im Gegensatz dazu behaupteten Forscher, die an der Entwicklung des HIV-Impfstoffs beteiligt waren, dass sie das „rationale Impfstoffdesign“ verwendeten, während sie tatsächlich nur die antigene Bindungskapazität eines Epitops in Bezug auf nur ein Paratop verbesserten und nicht die immunogene Kapazität eines Epitops, neutralisierende Antikörper hervorzurufen. Diese Schlussfolgerungen lösten starke Kritik aus .

Im Gegensatz dazu verwendet das vorliegende Forschungsthema das Konzept der „Epitopentdeckung und des synthetischen Impfstoffdesigns“, wie von Kao und Hodges (1) veranschaulicht. Diese Autoren zeigten, dass synthetische Impfstoffe auf der Basis kurzer Peptide, die immunogene Epitope darstellen, das Schutzpotential des nativen verwandten Gesamtproteins beeinträchtigen und sogar übertreffen können. Sie fanden höhere Antikörpertiter, die auf die Rezeptorbindungsdomäne des Pilus A von Pseudomonas aeruginosa gerichtet waren, der 14 Aminosäuren aufweist, als auf das gesamte Pilin-native Protein. Die Titer gegen das native Pilin der mit dem synthetischen Peptid-Konjugat immunisierten Tiere waren höher, als die Titer der mit dem gesamten Pilin-Protein immunisierten Tiere. Außerdem waren die Affinitäten der Anti-Peptid-Seren für die intakte Pilin-Rezeptor-bindende Domäne signifikant höher als die Affinitäten von Anti-Pilin-Protein-Seren (1).

Wir unterstützen die Entwicklung von Epitop-Impfstoffen, die Immuninformatik und experimentelle biologische Ansätze kombinieren (Alves-Silva et al.; Barbosa Santos et al.). Wir verwendeten einen immuninformatischen Ansatz, um die Wirksamkeit bestehender Impfstoffe zu verbessern, die aus Proteinantigenen bestehen, die nach ihrer Relevanz für frühere experimentelle biologische Ergebnisse ausgewählt wurden. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass Impfstoffe, die aus den immunogenen Domänen bestehen, das durch das gesamte Protein induzierte Schutzpotential optimieren und sogar übertreffen (1). Zum Beispiel erreichten wir eine 33% ige Optimierung der Impfstoffwirksamkeit, indem wir eine rekombinante Chimäre verwendeten, die anstelle des gesamten NH36-Proteins die beiden Domänen enthält, die die immunogensten Epitope der Nukleosidhydrolase NH36 von Leishmania enthalten (Alves-Silva et al.). Diese beiden Domänen (F1 und F3) enthalten die stärksten Epitope für die Erzeugung eines prophylaktischen Schutzes gegen Leishmania (L.) amazonensis-Infektion (Alves-Silva et al.). Die Impfung mit dem NH36-Protein reduziert die Läsionsgrößen um 55% (10). Die Impfung mit der F1- und der F3-Domäne ergab jedoch unabhängig voneinander jeweils eine Reduktion von 70 und 77%, und die F1F3-Chimäre induzierte eine Reduktion der Fußpolsterläsionsgrößen um 82% (Alves-Silva et al.).

Diese Begeisterung, die nach dem Aufkommen immuninformatischer Werkzeuge und der Entdeckung von Epitopen über In-Silico-Vorhersagen kommt, sollte die empirischen Grundlagen aller experimentellen Wissenschaft, die an der Entwicklung der Impfstoffe beteiligt ist, die Krankheiten bekämpfen, nicht entwerten (6). Im Gegenteil, sowohl die empirischen als auch die In-Silico-Werkzeuge sollten zusammen bei der Entwicklung neuer synthetischer Epitop-Impfstoffe verwendet werden, die Vorteile gegenüber herkömmlichen Impfstoffen bieten. Sie sind chemisch definierte Antigene, die frei von schädlichen Wirkungen sind. Darüber hinaus kehren sie im Gegensatz zu lebend-attenuierten Impfstoffen bei immungeschwächten Probanden nicht zur Virulenz zurück, und anders als bei genetischen Impfstoffen stellen sie keine ethischen Fragen.

Mit diesem Forschungsthema glaubten wir, einen wesentlichen Beitrag zur Entwicklung synthetischer Epitop-Impfstoffe geleistet zu haben, die bei der Prävention, Behandlung und Kontrolle von Infektionskrankheiten und Krebs helfen können.

Autorenbeiträge

CP-d-S, DSR und ISS haben den endgültigen Text dieses Editorials verfasst und genehmigt.

Erklärung zum Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagung

Die Autoren danken David Straker für seine Rezension.

Finanzierung

Diese Arbeit wurde vom Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) und der Fundação Carlos Chagas de Amparo à Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) unterstützt.