Testbeschreibung

MLH1-kodierende Exons 1-19, MSH2-kodierende Exons 1-16, MSH6-kodierende Exons 1-10 und PMS2-kodierende Exons 1-15 sowie bis weit in die 5′- und 3′-Enden aller Introns und nicht translatierten Regionen werden durch Sequenzierung analysiert. Die grobe Deletions- / Duplikationsanalyse bestimmt die Genkopienummer für alle kodierenden Exons von MLH1, MSH2, MSH6 und PMS2 sowie für das kodierende Exon 9 von EPCAM. Die Inversion der kodierenden Exons 1-7 des MSH2-Gens wird durch NGS nachgewiesen und durch PCR und Agarosegelelektrophorese bestätigt. Klinisch signifikante intronische Befunde jenseits von 5 Basenpaaren werden immer berichtet. Intronische Varianten von unbekannter oder unwahrscheinlicher klinischer Signifikanz werden nicht über 5 Basenpaare von der Spleißstelle berichtet. Genomische Desoxyribonukleinsäure (gDNA) wird unter Verwendung standardisierter Methoden aus der Probe des Patienten isoliert und quantifiziert. Die Sequenzanreicherung der zielgerichteten kodierenden Exons und benachbarter intronischer Nukleotide erfolgt durch eine Köder-Capture-Methode unter Verwendung langer biotinylierter Oligonukleotidsonden, gefolgt von Polymerasekettenreaktion (PCR) und Next Generation Sequencing (NGS). Die Sanger-Sequenzierung wird für alle Regionen durchgeführt, die fehlen oder eine unzureichende Abdeckung der Lesetiefe aufweisen, um eine zuverlässige Erkennung heterozygoter Varianten zu gewährleisten. Potenziell homozygote Varianten, Varianten in Regionen, die durch pseudogene Interferenz kompliziert sind, und Variantenaufrufe, die die Abdeck- und Variantenfrequenzqualitätsschwellenwerte nicht erfüllen, werden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert. Eine grobe Deletions- / Duplikationsanalyse von MLH1, MSH2, MSH6 und PMS2 unter Verwendung der Lesetiefe aus NGS-Daten und EPCAM unter Verwendung der multiplexligationsabhängigen Sondenamplifikation (MLPA) wird ebenfalls durchgeführt. Alle von NGS nachgewiesenen Kopienzahländerungen werden durch gezieltes chromosomales Microarray und / oder MLPA bestätigt. Wenn eine Deletion in den Exons 13, 14 oder 15 von PMS2 nachgewiesen wird, wird eine doppelsträngige Sequenzierung der entsprechenden Exons des Pseudogens, PMS2CL, durchgeführt, um festzustellen, ob sich die Deletion im PMS2-Gen oder Pseudogen befindet. Wenn in Exon 9 von EPCAM eine Deletion festgestellt wird, wird eine Deletions- / Duplikationsanalyse der kodierenden Exons 3 und 8 von EPCAM durchgeführt. Für EPCAM werden nur grobe Deletionen berichtet, die das 3′-Ende des Gens umfassen.