I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
Reacciones enzimáticas: (las imágenes se abrirán en una ventana nueva)

• Polimerización
• Corrección de pruebas
• Eliminación de imprimación

Polimerasa de ADN I participa en la replicación del ADN de procariotas. El crecimiento de la cadena de ADN está en la dirección de 5′ a 3′ con adición en el extremo hidroxilo de 3′. La nueva cadena está emparejada con la plantilla, y la nueva cadena y la plantilla son antiparalelas. La polimerasa I de ADN es la polimerasa más abundante y funciona para llenar los vacíos en el ADN que surgen durante la replicación, reparación y recombinación del ADN.

Historia:

La polimerasa de ADN I fue descubierta por Arthur Kornberg et al. en 1956. Sus resultados iniciales se presentaron por primera vez en la reunión anual de 1956 de la Federación de Sociedades Americanas para la Biología Experimental (FASEB) en Atlantic City, Nueva Jersey. Los revisores de su documento inicial sugiere que los autores se refieren al producto como «polydeoxyribonucleotide’ en lugar de ‘ADN’; El ‘ ADN ‘ solo fue aprobado después de una apelación al editor en jefe, John Edsall (Friedberg 2006). Dos artículos más fueron publicados en 1958 por Lehman et al. and Bessman et al., que estableció definitivamente la polimerasa de ADN estaba realizando replicación de ADN. Kornberg fue galardonado con el Premio Nobel en 1959 por su descubrimiento de la ADN polimerasa I.

En 1969, Jovin et al. aclaró la composición de aminoácidos (Jovin et al. 1969a, b). Ese mismo año, DeLucia y Cairns aislaron una E. cepa coli con una mutación que afectó a la ADN polimerasa y sorprendentemente encontró que el mutante sintetizó ADN normalmente. Este descubrimiento arrojó dudas sobre el papel de la polimerasa de ADN en la replicación y llevó a los grupos a buscar otras enzimas de replicación. Al mismo tiempo, Klenow y sus colegas mostraron que el tratamiento de la ADN polimerasa con la enzima proteolítica subtilisina (tipo Carlsberg) resultó en un aumento de la actividad de la polimerasa y una disminución de la actividad de la exonucleasa. La polimerasa de ADN resultante se aisló y se llamó «fragmento de Klenow» (Klenow y Henningsen 1970a, y Klenow y Overgaard-Hansen 1970).

En 1970, la polimerasa de ADN II de E. coli fue aislada y caracterizada por el hijo de Arthur Kornberg, Thomas Kornberg (Kornberg y Gefter 1970). La polimerasa de ADN II también fue reportada independientemente por Knippers y por Moses y Richardson en 1970 (Moses y Richardson 1970b). Un año después, Thomas Kornberg y Gefter identificaron la ADN polimerasa III (Kornberg y Gefter 1971).

El trabajo reciente con la ADN polimerasa I ha incluido la investigación de la base molecular de la especificidad del sustrato a través de estudios termodinámicos (Wowor et al. 2010) y experimentos de TRASTE de una sola molécula (Santoso et al. 2010). Hastings et al. han investigado las interacciones de las cinco polimerasas de ADN de E. coli durante el estrés celular (Hastings et al. 2010), y Kukreti et al.los estudios han tenido como objetivo determinar qué residuos son importantes para la actividad de la exonucleasa 3′-5′ (Kukreti et al. 2008).

Especificidad:

La síntesis de ADN requiere una hebra de imprimación con un terminal libre de 3 ‘ – hidroxilo recocido a una hebra de plantilla de ADN y los trifosfatos de desoxinucleótido forman pares de bases con la plantilla. La adición está en la dirección de 5’ a 3 ‘ con liberación de pirofosfato. La enzima es activa con DNAs que contienen huecos de una sola hebra y también con DNAs con roturas o muescas de una sola hebra. Bajo algunas condiciones, los híbridos ARN-ADN y un dúplex de ARN pueden servir como plantilla-imprimación (Setlow 1972).

La actividad de exonucleasa de 5′ a 3′ asociada a la ADN polimerasa I degrada el ADN de cadena simple y doble en la dirección de 5′ a 3′, produciendo mononucleótidos de 5′. La actividad de la exonucleasa de 5′ a 3′ es específica para el ADN de doble cadena, produciendo mononucleótidos y oligonucleótidos de 5′. La polimerasa I de ADN también puede extirpar regiones no coincidentes en el ADN (Setlow 1972).

La estructura similar de las polimerasas de ADN ha indicado que la mayoría de las enzimas de la polimerasa de ADN utilizan un mecanismo de polimerasa catalizada por dos iones metálicos idénticos. Un ion metálico activa el 3′-OH de la imprimación para atacar el a-fosfato del dNTP. El otro ion metálico estabiliza la carga negativa del oxígeno saliente y quela los fosfatos b y g (Steitz 1999).

El fragmento de Klenow es un producto proteolítico de la polimerasa I de ADN de E. coli que retiene la polimerización y la actividad de exonucleasa de 3′ a 5′, pero ha perdido la actividad de exonucleasa de 5 ‘a 3’.

Composición:

La polimerasa I de ADN es la enzima polimerizadora predominante que se encuentra en E. coli. Contiene un único enlace disulfuro y un grupo sulfhidrilo (Jovin et al. 1969b). Cinco polimerasas de ADN distintas se han aislado de E. coli y se han designado I, II, III, IV y V. La polimerasa de ADN I funciona para llenar los vacíos de ADN que surgen durante la replicación, reparación y recombinación del ADN. La polimerasa de ADN II también funciona en la edición y corrección de pruebas, principalmente en la hebra rezagada (Kim et al. 1997, Wagner y Nohmi 2000). La polimerasa de ADN III es la principal enzima replicativa. La polimerasa de ADN IV y V tienen grandes sitios activos que permiten una mayor asimilación de la base y, por lo tanto, son más propensos a errores. También carecen de subunidades de exonucleasas de corrección de pruebas para corregir las incorporaciones erróneas (Nohmi 2006, y Hastings et al. 2010). La polimerasa V de ADN está presente en niveles significativos solo en células inducidas por SOS y la sobreexpresión restringe la síntesis de ADN (Marsh y Walker 1985).

La forma de dominio de todas las polimerasas cuyas estructuras se conocen se ha descrito como una» mano derecha «con dominios de» pulgar»,» palma «y» dedo » (Kohlstaedt et al. 1992). Se cree que la región de la palma cataliza la transferencia de fosforilo, y se cree que la región del dedo interactúa con el nucleósido trifosfato entrante y la base de la plantilla con la que está emparejado. Se cree que el pulgar ayuda a posicionar el ADN y en la translocación (Brautigam y Steitz 1998).

Características moleculares:

El gen que codifica la ADN polimerasa I (polA) contiene aproximadamente 3.000 pares de bases y codifica aproximadamente 1.000 residuos de aminoácidos en una cadena simple de polipéptidos. Incluso organismos separados por mil millones de años de evolución (como los géneros Deinococcus-Thermus y E. coli) tienen aproximadamente un 35% de identidad de aminoácidos y aproximadamente un 50% de homología (Patel et al. 2001).

Número de adhesión a la proteína: P00582

Peso molecular:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Fragmento de Klenow: 70 kDa (filtración de gel, Klenow y Overgaard-Hansen 1970)

Ph óptimo:

• La actividad máxima se obtiene a pH 7,4 con tampón de fosfato de potasio para ADN nativo o sistemas de imprimación de plantillas de poli-dAT (Richardson et al. 1964)
• Fragmento de Klenow: Las actividades máximas se obtienen a 7,4 con tampón de fosfato y a 8.4 con tampón Tris-HCl

Punto isoeléctrico:

• 5,40 (Teórico)

Coeficiente de extinción:

Activadores:

• Se requiere un catión divalente para la actividad
• Mg2+ a una concentración de 7 mM produce una actividad óptima en las condiciones del ensayo estándar (Richardson et al. 1964)
• Mn2 + puede cumplir parcialmente el requisito de iones metálicos
• La actividad enzimática también está influenciada por concentraciones de cationes monovalentes como inhibidores K+, Rb+, Cs+ y NH4+

:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Incorporación de alto porcentaje de radiactividad para ensayos de traducción de nick
• Material de referencia estándar para el estudio de polimerasas de ADN
• Fabricación de copolímeros alternos como poly d (A-T)y homopolímeros como poly dG-poly dC
• Fragmento de Klenow: secuenciación de ADN (Sanger et al. 1977), relleno de voladizos de 5′ y eliminación de voladizos de 3′ para formar extremos romos (Sambrook 1989), y síntesis de segunda hebra en mutagénesis (Gubler 1987)