Descripción de la prueba

Los exones 1-19 de codificación de MLH1, los exones 1-16 de codificación de MSH2, los exones 1-10 de codificación de MSH6 y los exones 1-15 de codificación de PMS2, y bien en los extremos 5′ y 3′ de todos los intrones y regiones no traducidas se analizan mediante secuenciación. El análisis de deleción/duplicación macroscópica determina el número de copias de genes para todos los exones codificantes de MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2, y el exón codificante 9 de EPCAM. La inversión de los exones codificadores 1-7 del gen MSH2 es detectada por NGS y confirmada por PCR y electroforesis en gel de agarosa. Siempre se notifican hallazgos intrónicos clínicamente significativos por encima de 5 pares de bases. No se notifican variantes intrónicas de significación clínica desconocida o improbable más allá de 5 pares de bases desde la unión de empalme. El ácido desoxirribonucleico genómico (ADNg) se aísla de la muestra del paciente utilizando una metodología estandarizada y se cuantifica. El enriquecimiento secuencial de los exones codificadores objetivo y los nucleótidos intrónicos adyacentes se lleva a cabo mediante una metodología de captura de cebo, utilizando sondas de oligonucleótidos biotinilados largos, seguidas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación de próxima generación (NGS). La secuenciación de Sanger se realiza para cualquier región que falte o con una cobertura de profundidad de lectura insuficiente para la detección confiable de variantes heterocigotas. Las variantes potencialmente homocigotas, las variantes en regiones complicadas por interferencia de pseudogenos y las llamadas de variantes que no satisfacen los umbrales de profundidad de cobertura y calidad de frecuencia de alelos de variantes se verifican mediante secuenciación de Sanger. También se realiza un análisis de supresión/duplicación macroscópica de MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2 utilizando la profundidad de lectura de los datos de NGS y EPCAM utilizando amplificación de sonda dependiente de ligadura múltiple (MLPA). Cualquier cambio en el número de copias detectado por NGS es confirmado por microarray cromosómico dirigido y / o MLPA. Si se detecta una deleción en los exones 13, 14 o 15 de PMS2, se realizará una secuenciación de doble cadena de los exones apropiados del pseudógeno, PMS2CL, para determinar si la deleción se encuentra en el gen o pseudógeno PMS2. Si se detecta una eliminación en el exón 9 de EPCAM, se realizará un análisis de eliminación/duplicación de los exones de codificación 3 y 8 de EPCAM. Para EPCAM, solo se reportan deleciones macroscópicas que abarcan el extremo 3′ del gen.