La polimerasa Taq es una de las enzimas más omnipresentes de la biología molecular. Desde su descubrimiento en 19651, Taq se ha convertido en la columna vertebral de la PCR y de todas las aplicaciones posteriores que la tecnología permite. Esta potente polimerasa es la opción predeterminada para la mayoría de los procedimientos de amplificación y clonación, así como pruebas de diagnóstico, secuenciación de ADN de genes marcadores y mucho más.

¿Qué hace que la polimerasa Taq sea tan especial? En el artículo de hoy, echaremos un vistazo a las ventajas y desventajas de Taq, lo que necesita para obtener los mejores resultados de PCR de la polimerasa Taq y algunos derivados Taq que pueden ayudarlo a lograr mejores resultados para aplicaciones especializadas.

¿Por qué el Taq se Usa tan ampliamente para la PCR?

La popularidad de Taq se beneficia del hecho de que fue la primera polimerasa de alta temperatura descubierta por biólogos moleculares. Pero, esa no es la única razón por la que todavía tiene una demanda tan alta hoy en día.

La polimerasa Taq tiene la importante característica de ser estable a temperaturas de hasta 95°C2. Eso es crítico porque esta es la temperatura a la que el ADN se desnaturaliza, un paso requerido al comienzo de la reacción de PCR. Mientras que cualquier polimerasa de temperatura moderada también se desnaturalizaría a esa temperatura, haciéndola inútil, Taq permanece perfectamente listo para comenzar a polimerizar su muestra de ADN objetivo.

Además de eso, Taq tiene la ventaja de ser más activo en el rango de temperatura de 70-80°C2. Eso es lo suficientemente caliente como para que el ADN no vuelva a recocirse, pero los cebadores que se han recocido a temperaturas más bajas tampoco se despegarán. Por lo tanto, la polimerasa Taq funciona extremadamente bien a las temperaturas que la mayoría de las reacciones de PCR estándar requieren.

Finalmente, Taq se adapta a las necesidades básicas de biología molecular extremadamente bien. La polimerasa deja productos con cola A, que se pueden clonar fácilmente en un vector utilizando un kit de clonación TA estándar. El Taq también es relativamente resistente a las secuencias de ADN con una amplia gama de contenidos de GC y no es tan exigente con las concentraciones de ADN objetivo o dNTP.

¿Qué Necesita Taq para Polimerizar Eficazmente?

Si simplemente agregara polimerasa Taq por sí sola a una muestra de ADN, no sucedería mucho. Esto se debe a que, como la mayoría de las enzimas, Taq necesita una mezcla especializada de reactivos para funcionar correctamente.

El tampón Taq básico incluye cloruro de potasio, clorhidrato de Tris y Tritón X-100. Estos productos químicos son menos relevantes para optimizar sus reacciones de PCR que para mantener el Taq seguro durante el almacenamiento en el congelador – lo que en sí mismo es importante para aprovechar al máximo sus PCR. Si bien puede hacer su propio tampón para rehidratar y almacenar la enzima Taq liofilizada, la gran mayoría de la polimerasa se vende como una mezcla maestra con Taq ya suspendido en la solución tampón requerida.

Más crítico para sus reacciones de PCR es el cloruro de magnesio. El magnesio es un cofactor esencial para la polimerasa Taq3. Sin él, Taq no será capaz de catalizar la adición de nucleótidos a la imprimación o a la cadena de ADN en crecimiento. La concentración de magnesio también importa. A medida que se agrega más magnesio a una reacción de PCR, el Taq se vuelve más activo, pero también menos específico para polimerizar solo la cadena de ADN objetivo.

Debido al papel dependiente de la concentración del magnesio, puede encontrar mezclas maestras Taq con magnesio ya incluidas, así como mezclas que lo dejan fuera. En este último caso, deberá agregar cloruro de magnesio por separado (lo que requiere un paso de pipeteo adicional al preparar sus PCR). La ventaja es que puede controlar la concentración exacta de magnesio, por lo que puede experimentar para encontrar la combinación más óptima de productividad y especificidad de Taq.

¿Cuáles son los problemas con la polimerasa Taq?

Taq es ampliamente utilizado para PCR de rutina, pero desafortunadamente, no es perfecto para todas las aplicaciones. El inconveniente más notable de Taq es que no es la polimerasa más precisa que existe. Taq tiene una tasa de error de alrededor de un error por cada 100.000 base pairs4. En comparación, la polimerasa de corrección de UFP es aproximadamente 10 veces más precisa. Si está utilizando PCR antes de la clonación o la secuenciación de ADN, esa diferencia en la tasa de error puede ser muy significativa.

La polimerasa Taq estándar también puede tener problemas para amplificar secuencias de ADN objetivo de más de 1 kB. En relación a otros tipos de polimerasas, Taq ha procesividad baja, lo que significa que su eficacia disminuye significativamente con la longitud del amplicón. Esta baja processividad puede empeorar por la presencia de inhibidores de la PCR, que son comunes si se trabaja con ADN extraído de tejidos, plantas o suelo.

Finalmente, mientras que la polimerasa Taq es más eficiente a temperaturas superiores a 70 ° C, la enzima continúa trabajando a temperaturas inferiores a 50°C. Eso es problemático porque Taq puede polimerizar involuntariamente cebadores o secuencias de ADN no objetivo cuando la temperatura en su reacción de PCR cae para permitir que los cebadores se recocieran a su secuencia objetivo. Como resultado, se sabe que Taq produce dímeros de imprimación y otros productos no deseados que pueden interferir en aplicaciones posteriores, como la clonación.

Polimerasas Taq especializadas para Aplicaciones avanzadas

Afortunadamente, existen formas especializadas de polimerasa Taq que resuelven algunos de estos problemas. Por ejemplo, la polimerasa Highqu ALLin Taq es una versión sintética del Taq que tiene más processividad que el Taq estándar. Como resultado, puede lograr rendimientos de amplicón más fácilmente a partir de plantillas de alto GC, plantillas de más de 1 kB de longitud y muestras con concentraciones moderadas de inhibidores.

Otra forma común de Taq, como el Taq de arranque en caliente ALLin, está diseñado con un inhibidor molecular para inactivarlo a temperaturas más bajas. El Taq de arranque en caliente solo funciona después del calentamiento a 95°C. Esto reduce drásticamente la formación de dímeros de imprimación y amplicones inespecíficos como resultado de la polimerización antes del inicio de las reacciones de PCR. Como resultado, puede obtener rendimientos más altos al trabajar con secuencias de destino más largas y reducir los amplicones de fondo que normalmente requieren limpieza.

Conclusión

La polimerasa Taq ha sido durante mucho tiempo la enzima preferida para aplicaciones de PCR rutinarias y complejas. Se ajusta perfectamente a los requisitos de la reacción de PCR, al tiempo que simplifica las aplicaciones posteriores, como la clonación y la secuenciación. Aunque el Taq estándar tiene algunos inconvenientes, estos se resuelven en gran medida mediante el uso de una polimerasa Taq de arranque en caliente o de ingeniería. Para la gran mayoría de aplicaciones, la polimerasa Taq sigue siendo la enzima de referencia para los biólogos moleculares.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Frontiers in Microbiology 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostic Molecular Pathology: A Guide to Applied Molecular Testing (en inglés).

3 Williams M. 2018. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.