I.U.B.: 2.7.7.7
C.A.S.: 9012-90-2
Réactions enzymatiques : (les images s’ouvriront dans une nouvelle fenêtre)

• Polymérisation
• Relecture
• Enlèvement de l’amorce

L’ADN polymérase I participe à la réplication de l’ADN des procaryotes. La croissance de la chaîne d’ADN est dans la direction 5’ à 3’ avec addition à l’extrémité 3′ hydroxyle. La nouvelle chaîne est associée à la base du modèle, et la nouvelle chaîne et le nouveau modèle sont antiparallèles. L’ADN polymérase I est la polymérase la plus abondante et remplit les lacunes de l’ADN qui surviennent lors de la réplication, de la réparation et de la recombinaison de l’ADN.

Histoire :

L’ADN polymérase I a été découverte par Arthur Kornberg et al. en 1956. Ses premiers résultats ont été présentés pour la première fois lors de la réunion annuelle de 1956 de la Fédération des Sociétés Américaines de Biologie expérimentale (FASEB) à Atlantic City, dans le New Jersey. Les critiques de son article initial ont suggéré que les auteurs qualifient le produit de « polydéoxyribonucléotide » plutôt que d' »ADN’; « ADN » n’a été approuvé qu’après un appel au rédacteur en chef, John Edsall (Friedberg 2006). Deux autres articles ont été publiés en 1958 par Lehman et al. et Bessman et coll., qui a définitivement établi l’ADN polymérase effectuait la réplication de l’ADN. Kornberg a reçu le prix Nobel en 1959 pour sa découverte de l’ADN polymérase I.

En 1969, Jovin et al. élucidé la composition en acides aminés (Jovin et al. 1969a, b). La même année, DeLucia et Cairns ont isolé un E. souche de coli avec une mutation qui a affecté l’ADN polymérase et a découvert de manière surprenante que le mutant synthétisait l’ADN normalement. Cette découverte a jeté des doutes sur le rôle de l’ADN polymérase dans la réplication et a conduit des groupes à rechercher d’autres enzymes de réplication. Dans le même temps, Klenow et ses collègues ont montré que le traitement de l’ADN polymérase avec l’enzyme protéolytique subtilisine (type Carlsberg) entraînait une augmentation de l’activité de la polymérase et une diminution de l’activité de l’exonucléase. L’ADN polymérase obtenue a été isolée et a été nommée  » fragment de Klenow  » (Klenow et Henningsen, 1970a, et Klenow et Overgaard-Hansen, 1970).

En 1970, l’ADN polymérase II d’E. coli a été isolée et caractérisée par le fils d’Arthur Kornberg, Thomas Kornberg (Kornberg et Gefter, 1970). L’ADN polymérase II a également été rapportée indépendamment par Knippers et par Moses et Richardson en 1970 (Moses et Richardson, 1970b). Un an plus tard, Thomas Kornberg et Gefter ont identifié l’ADN polymérase III (Kornberg et Gefter, 1971).

Des travaux récents sur l’ADN polymérase I ont inclus l’étude de la base moléculaire de la spécificité du substrat par des études thermodynamiques (Wowor et al. 2010) et des expériences de FRET à molécule unique (Santoso et al. 2010). Hastings et coll. ont étudié les interactions des cinq ADN polymérases d’E. coli pendant le stress cellulaire (Hastings et al. 2010), et Kukreti et al.les études de ’ ont visé à déterminer quels résidus sont importants pour l’activité de l’exonucléase 3’-5′ (Kukreti et al. 2008).

Spécificité:

La synthèse de l’ADN nécessite un brin d’amorce avec une terminaison 3′-hydroxyle libre recuite en un brin de matrice d’ADN et les désoxynucléotides triphosphates forment des paires de bases avec la matrice. L’addition se fait dans le sens 5’ à 3’ avec libération de pyrophosphate. L’enzyme est active avec les ADN contenant des lacunes simple brin et également avec les ADN avec des ruptures ou des entailles à un brin. Dans certaines conditions, des hybrides ARN-ADN et un duplex ARN peuvent servir de matrice-amorce (Setlow, 1972).

L’activité exonucléase 5’ à 3’ associée à l’ADN polymérase I dégrade l’ADN simple et double brin dans la direction 5’ à 3’, donnant des 5’-mononucléotides. L’activité 5’ à 3′ exonucléase est spécifique de l’ADN double brin, donnant des 5’-mononucléotides et des oligonucléotides. L’ADN polymérase I peut également exciser des régions non appariées dans l’ADN (Setlow 1972).

La structure similaire des ADN polymérases a indiqué que la plupart des enzymes de l’ADN polymérase utilisent un mécanisme identique de polymérase catalysée par deux ions métalliques. Un ion métallique active le 3’-OH de l’amorce pour attaquer l’a-phosphate du dNTP. L’autre ion métallique stabilise la charge négative de l’oxygène sortant et chélate les phosphates b et g (Steitz, 1999).

Le fragment de Klenow est un produit protéolytique de l’ADN polymérase I d’E. coli qui conserve la polymérisation et l’activité exonucléase 3’à 5’, mais a perdu l’activité exonucléase 5′ à 3′.

Composition :

L’ADN polymérase I est l’enzyme polymérisante prédominante présente chez E. coli. Il contient une seule liaison disulfure et un groupe sulfhydryle (Jovin et al. 1969b). Cinq ADN polymérases distinctes ont été isolées d’E. coli et ont été désignées I, II, III, IV et V. L’ADN polymérase I remplit les lacunes de l’ADN qui surviennent lors de la réplication, de la réparation et de la recombinaison de l’ADN. L’ADN polymérase II fonctionne également dans l’édition et la relecture principalement dans le brin en retard (Kim et al. 1997, Wagner et Nohmi 2000). L’ADN polymérase III est la principale enzyme réplicative. L’ADN polymérase IV et V ont de grands sites actifs qui permettent une plus grande mauvaise incorporation des bases et sont donc plus sujettes aux erreurs. Ils manquent également de sous-unités de relecture-exonucléase pour corriger les erreurs d’incorporation (Nohmi 2006, et Hastings et al. 2010). L’ADN polymérase V n’est présente à des niveaux significatifs que dans les cellules induites par SOS et sa surexpression limite la synthèse de l’ADN (Marsh et Walker, 1985).

La forme de domaine de toutes les polymérases dont les structures sont connues a été décrite comme une ”main droite » avec des domaines ”pouce », ”paume » et ”doigt » (Kohlstaedt et al. 1992). On pense que la région de la paume catalyse le transfert de phosphoryle et que la région du doigt interagit avec le nucléoside triphosphate entrant et la base de matrice à laquelle elle est appariée. On pense que le pouce aide au positionnement de l’ADN et à la translocation (Brautigam et Steitz, 1998).

Caractéristiques moléculaires :

Le gène codant pour l’ADN polymérase I (polA) contient environ 3 000 paires de bases et code environ 1 000 résidus d’acides aminés dans une chaîne polypeptidique simple. Même les organismes séparés par un milliard d’années d’évolution (tels que les genres Deinococcus-Thermus et E. coli) ont une identité d’acides aminés d’environ 35 % et une homologie d’environ 50 % (Patel et al. 2001).

Numéro d’accession de la protéine: P00582

Poids moléculaire:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Fragment de Klenow : 70 kDa (filtration sur gel, Klenow et Overgaard-Hansen 1970)

Ph optimal :

• L’activité maximale est obtenue à pH 7,4 avec un tampon de phosphate de potassium pour les systèmes d’amorces-matrice d’ADN natif ou de poly dAT (Richardson et al. 1964)
• Fragment de Klenow : Les activités maximales sont obtenues à 7,4 avec le tampon phosphate et à 8.4 avec le tampon Tris-HCl

Point isoélectrique :

• 5,40 (théorique)

Coefficient d’extinction:

Activateurs:

• Un cation divalent est nécessaire pour l’activité
• Mg2+ à une concentration de 7 mM donne une activité optimale dans les conditions du test standard (Richardson et al. L’activité enzymatique est également influencée par les concentrations de cations monovalents tels que K+, Rb+, Cs+ et NH4+

Inhibiteurs:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Incorporation à haut pourcentage de radioactivité pour les tests de translation par nick
• Matériau de référence standard pour l’étude des ADN polymérases
• Fabrication de copolymères alternés tels que poly d (A-T) et d’homopolymères tels que poly dG-poly dC
• Fragment de Klenow: séquençage de l’ADN (Sanger et al. 1977), le remplissage de porte-à-faux en 5’ et le retrait de porte-à-faux en 3’ pour former des extrémités émoussées (Sambrook 1989), et la synthèse du deuxième brin en mutagenèse (Gubler 1987)