La Taq polymérase est l’une des enzymes les plus omniprésentes en biologie moléculaire. Depuis sa découverte en 19651, le Taq est devenu l’épine dorsale de la PCR et de toutes les applications en aval que la technologie permet. Cette polymérase puissante est le choix par défaut pour la plupart des procédures d’amplification et de clonage, ainsi que pour les tests de diagnostic, le séquençage de l’ADN des gènes marqueurs et bien plus encore.

Qu’est-ce qui rend la Taq polymérase si spéciale ? Dans l’article d’aujourd’hui, nous examinerons les avantages et les inconvénients du Taq, ce dont vous avez besoin pour obtenir les meilleurs résultats de PCR de la Taq polymérase, et certains dérivés du Taq qui peuvent vous aider à obtenir de meilleurs résultats pour des applications spécialisées.

Pourquoi le Taq est-il si largement utilisé pour la PCR?

La popularité de Taq bénéficie du fait qu’elle a été la première polymérase à haute température découverte par les biologistes moléculaires. Mais, c’est loin d’être la seule raison pour laquelle il est toujours aussi demandé aujourd’hui.

La Taq polymérase a la caractéristique importante d’être stable à des températures allant jusqu’à 95°C2. C’est essentiel car il s’agit de la température à laquelle l’ADN se dénature – une étape requise au début de la réaction de PCR. Alors que toute polymérase à température modérée se dénaturerait également à cette température, la rendant inutile, Taq reste parfaitement prête à commencer à polymériser votre échantillon d’ADN cible.

En plus de cela, Taq a l’avantage d’être le plus actif dans la plage de température de 70 à 80°C2. C’est assez chaud pour que l’ADN ne se régénère pas, mais les amorces qui ont recuit à des températures plus basses ne se décollent pas non plus. Ainsi, la Taq polymérase fonctionne extrêmement bien aux températures requises par la plupart des réactions PCR standard.

Enfin, le Taq répond extrêmement bien aux besoins de base de la biologie moléculaire. La polymérase laisse des produits à queue A, qui peuvent être facilement clonés dans un vecteur à l’aide d’un kit de clonage TA standard. Le Taq est également relativement résistant aux séquences d’ADN avec une large gamme de teneurs en GC et n’est pas si difficile en ce qui concerne les concentrations d’ADN cible ou de dNTP.

De quoi le Taq a-t-il besoin pour Polymériser Efficacement ?

Si vous ajoutiez simplement de la Taq polymérase seule à un échantillon d’ADN, il ne se passerait pas grand-chose. En effet, comme la plupart des enzymes, Taq a besoin d’un mélange spécialisé de réactifs pour fonctionner correctement.

Le tampon Taq basique comprend du chlorure de potassium, du chlorhydrate de Tris et du Triton X-100. Ces produits chimiques sont moins pertinents pour optimiser vos réactions de PCR que pour assurer la sécurité du Taq pendant le stockage au congélateur – ce qui en soi est important pour tirer le meilleur parti de vos PCR. Bien que vous puissiez fabriquer votre propre tampon pour réhydrater et stocker l’enzyme Taq lyophilisée, la grande majorité de la polymérase est vendue en mélange maître avec du Taq déjà en suspension dans la solution tampon requise.

Le chlorure de magnésium est plus critique pour vos réactions de PCR. Le magnésium est un cofacteur essentiel de la polymère Taq3. Sans cela, Taq ne sera pas en mesure de catalyser l’ajout de nucléotides à l’amorce ou au brin d’ADN en croissance. La concentration en magnésium compte également. À mesure que plus de magnésium est ajouté à une réaction de PCR, le Taq devient plus actif, mais aussi moins spécifique pour polymériser uniquement votre brin d’ADN cible.

En raison du rôle dépendant de la concentration du magnésium, vous pouvez trouver des mélanges maîtres Taq avec du magnésium déjà inclus ainsi que des mélanges qui le laissent de côté. Dans ce dernier cas, vous devrez ajouter du chlorure de magnésium séparément (ce qui nécessite une étape de pipetage supplémentaire lors de la préparation de vos PCR). L’avantage est que vous pouvez contrôler la concentration exacte de magnésium, de sorte que vous pouvez expérimenter pour trouver le mélange le plus optimal de productivité et de spécificité du Taq.

Quels sont les problèmes avec la Taq Polymérase?

Taq est largement utilisé pour les PCR de routine, mais malheureusement, il n’est pas parfait pour toutes les applications. L’inconvénient le plus notable de Taq est que ce n’est pas la polymérase la plus précise du marché. Taq a un taux d’erreur d’environ une erreur par 100 000 paires de bases4. En comparaison, la polymérase de relecture Pfu est environ 10 fois plus précise. Si vous utilisez la PCR en amont du clonage ou du séquençage de l’ADN, cette différence de taux d’erreur peut être très significative.

La polymérase Taq standard peut également avoir des problèmes avec l’amplification de séquences d’ADN cible de plus de 1 kB environ. Par rapport aux autres types de polymérases, la Taq a une faible processivité, ce qui signifie que son efficacité diminue considérablement avec la longueur de votre amplicon. Cette faible processivité peut être aggravée par la présence d’inhibiteurs de PCR, qui sont courants si vous travaillez avec de l’ADN extrait de tissus, de plantes ou de sol.

Enfin, alors que la Taq polymérase est la plus efficace à des températures supérieures à 70 ° C, l’enzyme continue de fonctionner à des températures inférieures à 50 ° C. C’est problématique car la Taq peut polymériser involontairement des amorces ou des séquences d’ADN non cibles lorsque la température de votre réaction de PCR diminue pour permettre aux amorces de se recuire à votre séquence cible. En conséquence, Taq est connu pour produire des dimères d’amorces et d’autres produits indésirables qui peuvent gêner les applications en aval comme le clonage.

Des Taq Polymérases spécialisées pour des applications avancées

Heureusement, il existe des formes spécialisées de Taq polymérase qui résolvent certains de ces problèmes. Par exemple, la polymérase highQu ALLin Taq est une version synthétique du Taq qui a plus de processivité que le Taq standard. En conséquence, vous pouvez plus facilement obtenir des rendements d’amplicon à partir de modèles à GC élevé, de modèles de plus de 1 kB de longueur et d’échantillons avec des concentrations modérées d’inhibiteurs.

Une autre forme courante de Taq, comme le Taq ALLin Hot Start, est conçue avec un inhibiteur moléculaire pour le rendre inactif à des températures plus basses. Le Taq à démarrage à chaud n’est fonctionnel qu’après chauffage à 95 ° C. Cela réduit considérablement la formation de dimères d’amorces et d’amplicons non spécifiques résultant de la polymérisation avant le début de vos réactions de PCR. En conséquence, vous pouvez obtenir des rendements plus élevés lorsque vous travaillez avec des séquences cibles plus longues et réduire les amplicons d’arrière-plan qui nécessitent normalement un nettoyage.

Conclusion

La Taq polymérase a longtemps été l’enzyme de choix pour les applications de PCR routinières et complexes. Il répond parfaitement aux exigences de la réaction PCR, tout en simplifiant les applications en aval telles que le clonage et le séquençage. Bien que la Taq standard présente certains inconvénients, ceux-ci sont en grande partie résolus en utilisant une polymérase Taq à démarrage à chaud ou à démarrage à chaud. Pour la grande majorité des applications, la Taq polymérase reste l’enzyme de référence pour les biologistes moléculaires.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Frontiers in Microbiology 5:465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Pathologie Moléculaire Diagnostique: Guide des Tests Moléculaires appliqués.

3 Williams M. 2018. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.