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DNAポリメラーゼI

by admin

I.u.B.:2.7.7.7
C.A.S.:9012-90-2
酵素反応:(画像は新しいウィンドウで開きます)

  • 重合
  • 校正
  • プライマー除去

DNAポリメラーゼIは、dna複製に関与しています。原核生物。 DNA鎖の成長は、3’ヒドロキシル末端に付加して5’から3’方向にある。 新しいチェーンはテンプレートとベースペアになり、新しいチェーンとテンプレートは反平行になります。 DNAポリメラーゼIは最も豊富なポリメラーゼであり、DNA複製、修復、および組換えの間に生じるDNAのギャップを埋めるために機能する。

歴史：

DNAポリメラーゼIはArthur Kornbergらによって発見されました。 1956年。 彼の最初の結果は、ニュージャージー州アトランティックシティで開催されたアメリカ実験生物学会連合（FASEB）の1956年年次総会で最初に発表された。 彼の最初の論文の査読者は、著者らが”DNA”ではなく”ポリデオキシリボヌクレオチド”として製品を参照することを示唆した; “DNA”は、編集長のJohn Edsall（Friedberg2006）にアピールした後にのみ承認されました。 さらに2つの論文が1958年にLehmanらによって出版された。 およびＢｅｓｓｍａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． DNAポリメラーゼを決定的に確立したDNA複製を行っていた。 コルンバーグは1959年にDNAポリメラーゼIの発見によりノーベル賞を受賞した。

1969年にJovin et al. アミノ酸組成を解明した（Jovin et al. 1969a、b）。 同年、DeLuciaとCairnsはEを単離した。 DNAポリメラーゼに影響を与える変異を有する大腸菌株は、驚くべきことに、変異体が正常にDNAを合成することを見出した。 この発見は、複製におけるDNAポリメラーゼの役割に疑問を投げかけ、他の複製酵素を探索するグループを導いた。 同時に、Klenowらは、タンパク質分解酵素subtilisin（タイプCarlsberg）によるDNAポリメラーゼの処理は、ポリメラーゼ活性の増加とエキソヌクレアーゼ活性の減少をもたらしたこと 得られたＤＮＡポリメラーゼを単離し、「Ｋｌｅｎｏｗ断片」と命名した（ＫｌｅｎｏｗおよびＨｅｎｎｉｎｇｓｅｎ１ ９ ７ ０ａ、およびＫｌｅｎｏｗおよびＯｖｅｒｇａａｒｄ−Ｈａｎｓｅｎ１ ９ ７ ０）。 1970年、Arthur Kornbergの息子Thomas Kornberg(Kornberg and Gefter1970)によって大腸菌のDNAポリメラーゼIIが単離され、特徴づけられた。 DNAポリメラーゼIIはまた、1970年にKnippersおよびMoses and Richardsonによって独立して報告された（Moses and Richardson1970b）。 1年後、Thomas KornbergとGefterはDNA polymerase IIIを同定した(Kornberg and Gefter1971)。

DNAポリメラーゼIの最近の研究には、熱力学的研究を通じて基質特異性の分子基盤を調べることが含まれている（Wowor et al. ２ ０ １ ０）および単一分子ＦＲＥＴ実験（Ｓａｎｔｏｓｏ ｅ ｔ ａ ｌ． 2010). ヘイスティングスら 細胞ストレス中の５つの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの相互作用を調査した（Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ２ ０ １ ０）、およびＫｕｋｒｅｔｉ ｅ ｔ ａ ｌ．らの研究は、どの残基が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性にとって重要であるかを決定することを目的としている（Ｋｕｋｒｅｔｉ ｅ ｔ ａ ｌ． 2008).

特異性:

DNA合成には、DNA鋳型鎖にアニールされた遊離の3′-ヒドロキシル末端を有するプライマー鎖が必要であり、デオキシヌクレオチド三リン酸は鋳型と塩基対を形成する。 付加はピロリン酸塩の解放との5’に3’方向にあります。 この酵素は、一本鎖のギャップを含むDnaと、一本鎖の切断またはニックを有するDnaとで活性である。 いくつかの条件下では、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドおよびＲＮＡ二重鎖は、鋳型−プライマーとして機能し得る（Ｓｅｔｌｏｗ１ ９ ７ ２）。

DNAポリメラーゼIに関連する5’から3’エキソヌクレアーゼ活性は、5’から3’方向に一本鎖および二本鎖DNAの両方を分解し、5′-単核種を生成する。

DNAポリメラーゼIに関連する5’から3’エキソヌクレアーゼ活性は、5′-単 5’から3’エキソヌクレアーゼ活性は、二本鎖DNAに特異的であり、5′-単核種およびオリゴヌクレオチドを生成する。 DNAポリメラーゼIは、DNA中の不一致領域を切除することもできる(Setlow1972)。

DNAポリメラーゼの同様の構造は、ほとんどのDNAポリメラーゼ酵素が同一の二つの金属イオン触媒ポリメラーゼ機構を使用することを示している。 1つの金属イオンはdNTPのa隣酸塩の攻撃のためのプライマーの3′-OHを活動化させます。 他の金属イオンは、脱酸素の負電荷を安定化し、b-およびg-リン酸塩をキレート化する（Steitz1999）。

Klenow断片は、重合および3’から5’エキソヌクレアーゼ活性を保持するが、5’から3’エキソヌクレアーゼ活性を失っている大腸菌DNAポリメラーゼIのタンパク

組成：

DNAポリメラーゼIは、大腸菌に見られる主要な重合酵素である。

それは、単一のジスルフィド結合および１つのスルフヒドリル基を含む（Ｊｏｖｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ． 1969b）。 DNAポリメラーゼIは、DNA複製、修復、および組換えの間に生じるDNAギャップを埋めるために機能します。 ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩはまた、主に遅延鎖において編集および校正においても機能する（Ｋｉｍ ｅ ｔ ａ ｌ． 1997,Wagner and Nohmi2000)。 DNAポリメラーゼIIIは主な複製酵素である。 DNAポリメラーゼIVおよびVは、より多くの塩基の誤incorporationを可能にする大きな活性部位を有し、したがって、より多くのエラーが発生しやすい。 彼らはまた、誤incorporationsを修正するために校正エキソヌクレアーゼサブユニットを欠いている(Nohmi2006,and Hastings et al. 2010). ＤＮＡポリメラーゼＶは、ＳＯＳ誘導細胞においてのみ有意なレベルで存在し、過剰発現はＤＮＡ合成を制限する（Ｍａｒｓｈ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ１ ９ ８ ５）。 構造が知られているすべてのポリメラーゼのドメイン形状は、「親指」、「手のひら」、および「指」ドメインを有する「右手」として記載されている（Kohlstaedt et al. 1992). 手のひら領域はホスホリル移動を触媒すると考えられ、指領域は入ってくるヌクレオシド三リン酸とそれが対になっているテンプレート塩基と相互作用すると考えられている。 親指は、ＤＮＡの位置決めおよび転座に役立つと考えられている（ＢｒａｕｔｉｇａｍおよびＳｔｅｉｔｚ１ ９ ９ ８）。

分子特性：

DNAポリメラーゼI（polA）をコードする遺伝子は、約3,000塩基対を含み、単純なポリペプチド鎖中に約1,000アミノ酸残基をコードする。

分子特性：

DNAポリメラーゼI（polA）をコードする遺伝子は、約3,000塩基対を含み、 十億年の進化によって分離された生物でさえ（Deinococcus-Thermus属やE. 大腸菌）は、約３ ５％のアミノ酸同一性および約５ ０％の相同性を有する（Patel et al. 2001).

タンパク質アクセッション番号：P00582

分子量：109kDa（Jovin et al. 1969a,b)

  • Klenow fragment:70kDa(gel filtration,Klenow and Overgaard-Hansen1970)

      • 最適pH:

      • 最大活性は、ネイティブDNAまたはポリdATテンプレート-プライマーシステム用のリン酸カリウム緩衝液を用いてpH7.4で得られる(Richardson et al. 1964)
      • Klenow fragment:最大活性はリン酸緩衝液で7.4、8で得られる。4トリス-HCl緩衝液を用いた

      等電点：

      • 5.40（理論的）

      消光係数：

      活性剤：

      • 二価のカチオンが活性に必要である
      • Mg2+7mMの濃度では、標準的なアッセイの条件下で最適な活性が得られる（Richardson et al. 1964)
      • Mn2+は部分的に金属イオン要件を満たすことができます
      • 酵素活性は、K+、Rb+、Cs+、NH4+などの一価カチオンの濃度によっても影響されます

      :

      • Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
      • Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
      • Dideoxynucleoside
      • Arabinosyl nucleotide triphosphate
      • Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
      • Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

      Applications:

      • ニック翻訳アッセイのための放射能の高い割合の取り込み
      • DNAポリメラーゼの研究のための標準的な参照材料
      • ポリd（A-T）などの交互共重合体とポリdG-ポリdCなどのホモポリマーの製造
      • Klenow fragment:DNA sequencing(Sanger et al. 1977）、5’突出部の充填および3’突出部の除去により平滑末端を形成する（Sambrook1989）、および突然変異誘発における第二鎖合成（Gubler1987）