Taqポリメラーゼは、分子生物学において最もユビキタスな酵素の一つである。 19651年の発見以来、TaqはPCRおよび技術が可能にするすべての下流の適用の背骨になった。 この強力なポリメラーゼはほとんどの拡大およびクローニングのプロシージャのためのデフォルトの選択、また診断試験、マーカーの遺伝子DNAの配列決定、およびTaqポリメラーゼを特別なものにするのは何ですか？

今日の記事では、Taqの長所と短所、Taqポリメラーゼから最高のPCR結果を得るために必要なもの、および特殊なアプリケーションでより良い結果を得るのに役立なぜTaqがPCRに広く使用されているのですか？

Taqの人気は、分子生物学者によって発見された最初の高温ポリメラーゼであるという事実から利益を得る。 しかし、それは今日まだそのような高い需要がある唯一の理由からはほど遠いです。

Taqポリメラーゼは、95℃までの温度で安定であるという重要な特性を有する2。 これはDNAが変性する温度であるため、PCR反応の開始時に必要なステップであるため、重要です。 適度な温度のポリメラーゼもその温度で変性して役に立たなくなりますが、TaqはターゲットDNAサンプルの重合を開始する準備ができています。その上で、Taqに70-80°Cの温度range2で最も活発であることの利点があります。 それはDNAが再アニールしないことを十分に熱いですが、より低い温度でアニールしたプライマーはどちらか、剥離しません。 そのため、Taqポリメラーゼは、ほとんどの標準的なPCR反応が必要とする温度で非常にうまく機能します。最後に、Taqは基本的な分子生物学のニーズに非常によく合っています。 ポリメラーゼは、標準的なTAクローニングキットを使用してベクターに容易にクローン化することができるa尾生成物を残します。 Ｔａｑはまた、広範囲のＧＣ含有量を有するＤＮＡ配列に対しても比較的弾力性があり、標的ＤＮＡまたはｄＮＴＰ濃度についてはそれほど好き嫌いがあるわけではない。

Taqは効果的に重合するために何が必要ですか？あなたは、単にDNAのサンプルにTaqポリメラーゼを単独で追加した場合、多くは起こりません。

あなたは、DnaのサンプルにTaqポリメラーゼを単独で追加した場合、あまり起こりません。 それはほとんどの酵素のように、Taqがきちんと働くために試薬の専門にされた組合せを必要とするのである。

基本的なTaq緩衝液は、塩化カリウム、塩酸トリス、およびTriton X-100を含む。 これらの化学物質は、冷凍庫での保管中にTaqを安全に保つよりも、PCR反応を最適化することにはあまり関連していません。 凍結乾燥したTaq酵素を再水和して保存するために独自の緩衝液を作ることができますが、ポリメラーゼの大部分は、Taqが既に必要な緩衝液に懸濁されているマスターミックスとして販売されています。あなたのPCR反応にとってより重要なのは塩化マグネシウムです。

マグネシウムはTaqポリメラーゼ3のための必要な補因子である。 それがなければ、Taqはプライマーまたは成長するDNA鎖へのヌクレオチドの添加を触媒することができません。 マグネシウムの濃度も重要です。 より多くのマグネシウムがPCR反応に添加されるにつれて、Taqはより活性になりますが、標的DNA鎖のみを重合する際の特異性も低くなります。

マグネシウムの濃度依存的な役割のために、すでに含まれているマグネシウムとTaqマスターミックスだけでなく、それを除外するミックスを見つ 後者の場合、塩化マグネシウムを別々に追加する必要があります（Pcrを準備するときに余分なピペッティング手順が必要です）。 利点は、マグネシウムの正確な濃度を制御できるため、Taqの生産性と特異性の最適なブレンドを見つけるために実験することができることです。

Taqポリメラーゼの問題は何ですか？Taqは日常的なPcrに広く使用されていますが、残念ながら、すべてのアプリケーションに最適ではありません。 Taqの最も顕著な欠点は、それがそこに最も正確なポリメラーゼではないということです。 Taqのエラー率は、100,000ベースペアあたり約一つのエラー4です。 比較すると、Pfu校正ポリメラーゼは約10倍正確です。 クローニングまたはDNAシークエンシングの上流でPCRを使用している場合、エラー率の違いは非常に重要です。標準的なTaqポリメラーゼは、約1kBよりも長い標的DNA配列を増幅することにも問題がある可能性がある。

他のタイプのポリメラーゼと比較して、Taqは低いprocessivityを持っています、従って効率はあなたのアンプリコンの長さとかなり低下することを意味します。 この低い処理性は、組織、植物、または土壌から抽出されたDNAを使用している場合に一般的なPCR阻害剤の存在によって悪化する可能性があります。

最後に、Taqポリメラーゼは70℃以上の温度で最も効率的ですが、酵素は50℃未満の温度で働き続けます。Taqは、PCR反応の温度が低下してプライマーが標的配列にアニールすることを可能にするときに、プライマーまたは非標的DNA配列を意図せずに重合させる可能性があるため、問題があります。 その結果、Taqはクローニングのような下流の適用の方法で得ることができる他の不必要なプロダクトおよびプライマー二量体を作り出すと知られてい

高度なアプリケーションのための専門Taqポリメラーゼ

ありがたいことに、これらの問題のいくつかを解決するTaqポリメラーゼ 例えば、Ｈｉｇｈｑ Ａｌｌｉｎ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、標準Ｔａｑよりも多くの処理性を有するＴａｑの合成バージョンである。 その結果、高GCテンプレート、長さが1kBより長いテンプレート、および中程度の濃度の阻害剤を含むサンプルからのアンプリコン収率をより簡単に達成別の一般的な形態のTaqは、ALLin Hot Start Taqのように、より低い温度で不活性にするために分子阻害剤を使用して設計されています。

ホットスタートTaqは、PCR反応の開始前に重合の結果としてプライマー二量体および非特異的アンプリコンの形成を劇的に減少させる95℃に加熱した後に その結果、より長いターゲットシーケンスを使用すると、より高い収率を得ることができ、通常はクリーンアップを必要とするバックグラウンドアンプリコンを削減することができます。

結論

Taqポリメラーゼは、長いルーチンと複雑なPCRアプリケーションの両方のための選択の酵素となっています。 PCR反応の要件に完全に適合し、クローニングやシークエンシングなどの下流アプリケーションを簡単に作成できます。 標準的なTaqにはいくつかの欠点がありますが、これらは主に設計されたまたはホットスタートTaqポリメラーゼを使用することによっ 大部分のアプリケーションでは、Taqポリメラーゼは、分子生物学者のためのgo-to酵素のままです。

1石野S,石野Y.2014. 微生物学のフロンティア5:465.

2コールマンWB、ツォンガリスGJ。 2017. 診断分子病理学：応用分子検査へのガイド。

3ウィリアムズM.2018。 Sciencing

4McInerney,Adams P,Hadi MZ. 2014. 287430.