I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
reacții enzimatice: (imaginile se vor deschide într-o fereastră nouă)

• polimerizare
• corectură
• Primer Removal

ADN polimeraza i participă la replicarea ADN-ului procariote. Creșterea lanțului ADN este în direcția 5 ‘până la 3′ cu adăugare la capătul hidroxil 3’. Noul lanț este asociat de bază cu șablonul, iar noul lanț și șablon sunt antiparalel. ADN polimeraza I este cea mai abundentă polimerază și funcționează pentru a umple golurile din ADN care apar în timpul replicării, reparării și recombinării ADN-ului.

Istorie:

ADN polimeraza I a fost descoperită de Arthur Kornberg și colab. în 1956. Rezultatele sale inițiale au fost prezentate pentru prima dată la reuniunea anuală din 1956 a Federației Societăților Americane pentru Biologie Experimentală (FASEB) în Atlantic City, New Jersey. Recenzorii lucrării sale inițiale au sugerat că autorii se referă la produs ca ‘polideoxiribonucleotidă’ mai degrabă decât ‘ADN’; ADN-ul a fost aprobat doar după un apel adresat redactorului-șef, John Edsall (Friedberg 2006). Alte două lucrări au fost publicate în 1958 de Lehman și colab. și Bessman și colab., care a stabilit definitiv ADN polimeraza efectua replicarea ADN-ului. Kornberg a primit Premiul Nobel în 1959 pentru descoperirea ADN polimerazei I.

în 1969, Jovin și colab. elucidat compoziția de aminoacizi (Jovin și colab. 1969a, b). În același an, DeLucia și Cairns au izolat un E. tulpina coli cu o mutație care a afectat ADN polimeraza și a constatat în mod surprinzător că mutantul a sintetizat ADN-ul în mod normal. Această descoperire a pus la îndoială rolul ADN polimerazei în replicare și a determinat grupurile să caute alte enzime de replicare. În același timp, Klenow și colegii săi au arătat că tratamentul ADN polimerazei cu enzima proteolitică subtilisin (Tip Carlsberg) a dus la o creștere a activității polimerazei și la scăderea activității exonucleazei. ADN polimeraza rezultată a fost izolată și a fost numită „fragmentul Klenow” (Klenow și Henningsen 1970a și Klenow și Overgaard-Hansen 1970).

în 1970, ADN polimeraza II A E. coli a fost izolată și caracterizată de fiul lui Arthur Kornberg, Thomas Kornberg (Kornberg și Gefter 1970). ADN polimeraza II a fost, de asemenea, raportată independent de Knippers și de Moses și Richardson în 1970 (Moses și Richardson 1970b). Un an mai târziu, Thomas Kornberg și Gefter au identificat ADN polimeraza III (Kornberg și Gefter 1971).

lucrările recente cu ADN polimeraza I au inclus investigarea bazei moleculare a specificității substratului prin studii termodinamice (Wowor și colab. 2010) și experimente cu FRET cu o singură moleculă (Santoso și colab. 2010). Hastings și colab. au investigat interacțiunile celor cinci ADN polimeraze E. coli în timpul stresului celular (Hastings și colab. 2010), și Kukreti și colab.studiile au urmărit să determine ce reziduuri sunt importante pentru activitatea exonucleazei 3′-5 ‘(Kukreti și colab. 2008).

specificitate:

sinteza ADN necesită o catenă de primer cu un terminal liber de 3′-hidroxil recoaptă la o catenă de șablon ADN și trifosfații deoxinucleotidici formează perechi de baze cu șablonul. Adăugarea este în direcția 5′ la 3′ cu eliberarea de pirofosfat. Enzima este activă cu ADN-uri care conțin goluri monocatenare și, de asemenea, cu ADN-uri cu pauze sau crestături cu o singură catenă. În anumite condiții, hibrizii ARN-ADN și un duplex ARN pot servi ca șablon-primer (Setlow 1972).

activitatea exonucleazei 5′ până la 3′ asociată cu ADN polimeraza I degradează atât ADN-ul monocatenar, cât și cel dublu catenar în direcția 5′ până la 3′, producând 5′ – Mononucleotide. Activitatea exonucleazei de la 5′ la 3’este specifică ADN-ului dublu catenar, producând 5′ – Mononucleotide și oligonucleotide. ADN polimeraza i poate acciza, de asemenea, regiuni nepotrivite în ADN (Setlow 1972).

structura similară a ADN polimerazelor a indicat faptul că majoritatea enzimelor ADN polimerazei utilizează un mecanism identic de polimerază catalizat cu doi ioni metalici. Un ion metalic activează primerul 3 ‘ – OH pentru atacul asupra a-fosfatului dNTP. Celălalt ion metalic stabilizează sarcina negativă a oxigenului care pleacă și chelează fosfații b și g (Steitz 1999).

fragmentul Klenow este un produs proteolitic al ADN polimerazei i E. coli care reține polimerizarea și activitatea exonucleazei de la 3′ la 5′, dar a pierdut activitatea exonucleazei de la 5′ la 3′.

compoziție:

ADN polimeraza I este enzima polimerizantă predominantă Găsită în E. coli. Conține o singură legătură disulfură și o grupare sulfhidril (Jovin și colab. 1969b). Cinci ADN polimeraze distincte au fost izolate de E. coli și au fost desemnate I, II, III, IV și V. ADN polimeraza i funcționează pentru a umple golurile ADN care apar în timpul replicării, reparării și recombinării ADN-ului. ADN polimeraza II funcționează, de asemenea, în editare și corectare, în principal în catena rămasă (Kim și colab. 1997, Wagner și Nohmi 2000). ADN polimeraza III este principala enzimă replicativă. ADN polimeraza IV și V au situsuri active mari care permit o mai mare încorporare a bazei și, prin urmare, sunt mai predispuse la erori. De asemenea, le lipsește subunitățile de corectare-exonuclează pentru a corecta corporațiile greșite (Nohmi 2006 și Hastings și colab. 2010). ADN polimeraza V este prezentă la niveluri semnificative numai în celulele induse de SOS și supraexprimarea restricționează sinteza ADN-ului (Marsh și Walker 1985).

forma domeniului tuturor polimerazelor ale căror structuri sunt cunoscute a fost descrisă ca o „mână dreaptă” cu domenii „degetul mare”, „palma” și „degetul” (Kohlstaedt și colab. 1992). Se crede că regiunea palmei catalizează transferul de fosforil, iar regiunea degetului se crede că interacționează cu trifosfatul nucleozidic de intrare și baza șablonului cu care este asociat. Se crede că degetul mare ajută la poziționarea ADN-ului și la translocare (Brautigam și Steitz 1998).

caracteristici moleculare:

gena care codifică ADN polimeraza I (polA) conține aproximativ 3.000 de perechi de baze și codifică aproximativ 1.000 de reziduuri de aminoacizi într-un lanț polipeptidic simplu. Chiar și organismele separate de un miliard de ani de evoluție (cum ar fi Deinococcus-Thermus genurile și E. coli) au aproximativ 35% identitate de aminoacizi și aproximativ 50% omologie (Patel și colab. 2001).

Numărul de aderare a proteinei: P00582

greutate moleculară:

• 109 kDa (Jovin și colab. 1969a, b)
• fragment Klenow: 70 kDa (filtrare cu gel, Klenow și Overgaard-Hansen 1970)

pH optim:

• activitatea maximă se obține la pH 7,4 cu tampon fosfat de potasiu pentru sisteme native de ADN sau poli dat șablon-grund (Richardson și colab. 1964)
• fragment Klenow: activitățile maxime sunt obținute la 7,4 cu tampon fosfat și la 8.4 cu tampon Tris-HCl

punct izoelectric:

• 5.40 (Teoretic)

Coeficient de extincție:

activatori:

• este necesar un cation bivalent pentru activitatea
• Mg2+ la o concentrație de 7 mM produce o activitate optimă în condițiile testului standard (Richardson și colab. 1964)
• Mn2+ poate îndeplini parțial cerința ionului metalic
• activitatea enzimei este influențată și de concentrațiile de cationi monovalenți precum K+, Rb+, Cs+ și NH4+

inhibitori:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• încorporarea procentuală ridicată a radioactivității pentru testele de traducere nick
• material de referință Standard pentru studiul ADN polimerazelor
• fabricarea de copolimeri alternanți, cum ar fi poli D(A-T) și homopolimeri, cum ar fi poli DG-poli DC
• fragment Klenow: secvențierea ADN-ului (Sanger și colab. 1977), completarea a 5 ‘console și îndepărtarea a 3’ console pentru a forma capete contondente (Sambrook 1989) și sinteza a doua catenă în mutageneză (Gubler 1987)