polimeraza Taq este una dintre cele mai omniprezente enzime din biologia moleculară. De la descoperirea sa în 19651, Taq a devenit coloana vertebrală a PCR și a tuturor aplicațiilor din aval pe care le permite tehnologia. Această polimerază puternică este alegerea implicită pentru majoritatea procedurilor de amplificare și clonare, precum și pentru testele de diagnostic, secvențierea ADN-ului genei marker și multe altele.

ce face polimeraza Taq atât de specială? În articolul de astăzi, vom arunca o privire asupra avantajelor și dezavantajelor Taq, a ceea ce aveți nevoie pentru a obține cele mai bune rezultate PCR din polimeraza Taq și a unor derivați Taq care vă pot ajuta să obțineți rezultate mai bune pentru aplicații specializate.

De ce este Taq atât de utilizat pe scară largă pentru PCR?

popularitatea lui Taq beneficiază de faptul că a fost prima polimerază la temperatură înaltă descoperită de biologii moleculari. Dar, acesta este departe de singurul motiv pentru care este încă la o cerere atât de mare astăzi.

polimeraza Taq are caracteristica importantă de a fi stabilă la temperaturi de până la 95 centic2. Acest lucru este esențial, deoarece aceasta este temperatura la care ADN – ul se denaturează-un pas necesar la începutul reacției PCR. În timp ce orice polimerază cu temperatură moderată s-ar denatura și la acea temperatură, făcând-o inutilă, Taq rămâne perfect pregătit să înceapă polimerizarea probei de ADN țintă.

În plus, Taq are avantajul de a fi cel mai activ în intervalul de temperatură 70-80 C2. E suficient de fierbinte încât ADN-ul nu se va reanaliza, dar nici primerii care s-au recoăcut la temperaturi mai scăzute nu se vor dezlipi. Deci, polimeraza Taq funcționează extrem de bine la temperaturile cele mai standard reacții PCR necesită.

în cele din urmă, Taq se potrivește biologiei moleculare de bază are nevoie extrem de bine. Polimeraza lasă produse cu coadă A, care pot fi ușor clonate într-un vector folosind un kit standard de clonare TA. Taq este, de asemenea, relativ rezistent la secvențele ADN cu o gamă largă de conținut GC și nu este atât de pretențios în ceea ce privește concentrațiile țintă de ADN sau dNTP.

De ce are nevoie Taq pentru a polimeriza eficient?

dacă ați adăugat pur și simplu polimeraza Taq pe cont propriu la o probă de ADN, nu s-ar întâmpla prea multe. Acest lucru se datorează faptului că, la fel ca majoritatea enzimelor, Taq are nevoie de un amestec specializat de reactivi pentru a funcționa corect.tamponul Taq de bază include clorură de potasiu, clorhidrat de Tris și Triton X-100. Aceste substanțe chimice sunt mai puțin relevante pentru optimizarea reacțiilor PCR decât pentru păstrarea Taq în siguranță în timpul depozitării în congelator – ceea ce în sine este important pentru a profita la maximum de PCR-urile dvs. În timp ce vă puteți crea propriul tampon pentru a rehidrata și a stoca enzima Taq liofilizată, marea majoritate a polimerazei este vândută ca un amestec principal cu Taq deja suspendat în soluția tampon necesară.

mai critică pentru reacțiile PCR este clorura de magneziu. Magneziul este un cofactor esențial pentru polimeraza Taq3. Fără ea, Taq nu va putea cataliza adăugarea de nucleotide la primer sau la lanțul ADN în creștere. Concentrația de magneziu contează, de asemenea. Pe măsură ce se adaugă mai mult magneziu la o reacție PCR, Taq devine mai activ, dar și mai puțin specific în polimerizarea numai a catenei ADN țintă.datorită rolului dependent de concentrație al magneziului, puteți găsi amestecuri Taq master cu magneziu deja inclus, precum și amestecuri care îl lasă afară. În acest din urmă caz, va trebui să adăugați clorură de magneziu separat (ceea ce necesită o etapă suplimentară de pipetare la pregătirea PCR-urilor). Avantajul este că puteți controla concentrația exactă de magneziu, astfel încât să puteți experimenta pentru a găsi cel mai optim amestec de productivitate și specificitate Taq.

care sunt problemele cu polimeraza Taq?

Taq este utilizat pe scară largă pentru PCR-uri de rutină, dar, din păcate, nu este perfect pentru toate aplicațiile. Cel mai notabil dezavantaj al Taq este că nu este cea mai precisă polimerază de acolo. Taq are o rată de eroare de aproximativ o eroare la 100.000 de perechi de bază4. Prin comparație, PFU corectură polimeraza este de aproximativ 10 ori mai precisă. Dacă utilizați PCR în amonte de clonare sau secvențiere ADN, această diferență în rata de eroare poate fi foarte semnificativă.

polimeraza Taq Standard poate avea, de asemenea, probleme cu amplificarea secvențelor ADN țintă mai lungi de aproximativ 1 kB. În raport cu alte tipuri de polimeraze, Taq are o procesivitate scăzută, ceea ce înseamnă că eficiența sa scade semnificativ cu lungimea ampliconului. Această procesivitate scăzută poate fi agravată de prezența inhibitorilor PCR, care sunt obișnuiți dacă lucrați cu ADN extras din țesuturi, plante sau sol.

în cele din urmă, în timp ce polimeraza Taq este cea mai eficientă la temperaturi de peste 70% C, enzima continuă să funcționeze la temperaturi mai mici de 50% C. Acest lucru este problematic, deoarece Taq poate polimeriza neintenționat primeri sau secvențe de ADN nețintă atunci când temperatura din reacția PCR scade pentru a permite primerilor să se recoacă la secvența țintă. Ca rezultat, se știe că Taq produce dimeri de grund și alte produse nedorite care pot împiedica aplicațiile din aval, cum ar fi clonarea.

polimeraze Taq specializate pentru aplicații avansate

Din fericire, există forme specializate de polimerază Taq care rezolvă unele dintre aceste probleme. De exemplu, highqu Allin Taq polimeraza este o versiune sintetică a Taq care are mai multă procesivitate decât Taq standard. Ca rezultat, puteți obține mai ușor randamente amplicon din șabloane cu GC ridicat, șabloane cu o lungime mai mare de 1 kB și probe cu concentrații moderate de inhibitori.o altă formă comună de Taq, cum ar fi Allin Hot Start Taq, este proiectată cu un inhibitor molecular pentru a o face inactivă la temperaturi mai scăzute. Pornirea la cald Taq este funcțională numai după încălzirea la 95 de centi C. Acest lucru reduce dramatic formarea dimerilor de grund și a ampliconilor nespecifici ca urmare a polimerizării înainte de începerea reacțiilor PCR. Drept urmare, puteți obține randamente mai mari atunci când lucrați cu secvențe țintă mai lungi și reduceți amplicoanele de fundal care necesită în mod normal curățare.

concluzie

Taq polimeraza a fost mult timp enzima de alegere atât pentru aplicațiile PCR de rutină, cât și pentru cele complexe. Se potrivește perfect cerințelor reacției PCR, făcând în același timp aplicații în aval, cum ar fi clonarea și secvențierea simplă. Deși Taq standard are unele dezavantaje, acestea sunt rezolvate în mare măsură prin utilizarea unei polimeraze Taq proiectate sau cu pornire la cald. Pentru marea majoritate a aplicațiilor, polimeraza Taq rămâne enzima de bază pentru biologii moleculari.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Frontiere în Microbiologie 5: 465.

2 Coleman BM, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostic Patologie Moleculară: un ghid pentru testarea moleculară aplicată.

3 Williams M. 2018. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.