Disk degenerace je běžné onemocnění s komplexní multifaktoriální etiologii. 1 Low-grade infekce byla navržena jako příčina degenerace plotének s Propionibacterium akné identifikovány v 84% pacientů s herniace disku a ischias pomocí sérologie a kultur. 2 Molekulární změny byly také pozorovány například zvýšená produkce katabolických enzymů (cathepsin, lysozym a několik matrix metaloproteinázy) a zánětlivých cytokinů. 3 mladí pacienti s herniací bederního disku vykazovali po operaci horší zotavení, když předoperačně vykazovali zvýšené sérové koncentrace vysoce citlivého C-reaktivního proteinu (hs-CRP). Není však jasné, zda vysoké hladiny CRP a zánětlivých cytokinů naznačují lokální infekci nebo zánětlivou odpověď na herniaci disku. 4

patogeny, jako je virus Parvo B19 nebo Virus Epstein Barr (EBV), hrají důležitou roli v patogenezi různých forem artritidy. 5,6 Herpes viry jsou různorodá rodina velkých DNA virů, z nichž všechny mohou vytvořit celoživotní latentní infekce. Primární infekce mnoha z těchto virů je běžná v dětství. 7,8

Tato studie zaměřené na zjištění potenciálních roli herpes viry, Herpes Simplex Virus typu 1(HSV-1), Herpes Simplex Virus typ 2 (HSV-2) a Cytomegalovirus (CMV), v patogenezi degenerace meziobratlové ploténky. Molekulární analýza meziobratlové ploténky vzorky získané během postdiskektomického ukázal značnou frekvenci CMV a HSV-1 DNA v degenerované ploténky, což naznačuje, že virová infekce by mohla být důležitým faktorem v etiologii tohoto onemocnění.

Pacienti a Metody

celkem 16 po sobě jdoucích pacientů, kteří podstoupili postdiskektomického do šesti měsíců od bederní herniace disku byly studovány. Bylo tam osm mužů a osm žen s průměrným věkem 40,38 let (17 až 65 let). Studie měla etický souhlas. Diagnóza herniace bederního disku byla stanovena fyzikálním vyšetřením a MRI. Za účelem zajištění kontrolní skupiny byly vzorky disků získány perkutánně od dvou pacientů s torakolumbálními zlomeninami, kteří podstoupili operaci. Tito pacienti také podstoupili předoperační vyšetření MRI, aby se vyloučila souběžná degenerace. Povaha vzorků testovaných v této studii neumožňuje zahrnutí více meziobratlových plotének od zdravých jedinců z etických důvodů, zatímco alternativní kadaverózní vzorky jako kontrolní, byla opuštěná, protože většina dospělé populace má historii nízká bolesti zad a disk degenerace.

kromě materiálu z herniated disk získané během postdiskektomického periferní krve byl odebrán vzorek z každého pacienta. Vzorky tkáně byly umístěny do sterilizovaného polypropylenu 1.5 ml zkumavek a skladováno při -80°C, dokud nebyla provedena extrakce DNA/RNA a polymerázová řetězová reakce/ kvantitativní polymerázová řetězová reakce (PCR/qRT-PCR). Detekce protilátek HSV-1 a CMV, IgM+ a IgG+ z plazmy byla provedena pomocí standardního enzymatického imunoanalýzy.

extrakce DNA/RNA.

Genomické DNA a celková RNA byla extrahována ze vzorků pomocí NucleoSpin Tissue XS kit NucleoSpin RNA XS kit (Macherey-Nagel GmbH a Co., Düren, Německo), respektive podle pokynů výrobce. Purifikovaná RNA byla dále ošetřena DNaseI, aby se zabránilo kontaminaci DNA. Koncentrace vzorků DNA a RNA byly stanoveny pomocí spektrofotometru (260 nm) před amplifikací PCR nebo qRT-PCR.

detekce DNA herpetických virů.

testovali Jsme osm různých herpetických virů (HSV-1/-2, Varicella Zoster Virus (VZV), EBV, CMV, Herpes Viry, 6, 7 a 8 (HHV6, HHV7 a HHV8)) pomocí RhyMA Test-Herpes Screening podle pokynů výrobce (Euroclone, Pavia, Itálie). Na RhyMA test byl založen na Reverzní Hybridizace technologie zahrnující multiplex DNA, amplifikace pomocí PCR se specifickými biotinylated primery, následuje hybridizace amplifikovaného a biotinylated fragmentů DNA s proužky na sondy, specifické pro každý z herpes viru. Pro vyhodnocení výsledků byla vyžadována konečná vyvíjející se reakce pomocí biotin-streptavidinového systému. V každém proužku byly také zahrnuty pozitivní a amplifikační kontroly. Pro interpretaci výsledků byl vyvinutý pás každého vzorku zarovnán se standardní tabulkou. Test RhyMA-Screening herpesu je licencován pro diagnostické použití in vitro, což potvrzuje vysokou specificitu a citlivost testu. Za účelem ověření výsledků získaných pomocí RhyMA Test-Herpes screening test, PCR produkty byly také spustit v 3% nízkotající agarózy gel produkovat očekávané elektroforetické vzor pro každý virus. Nakonec byly vzorky pozitivní na PCR podrobeny přímé sekvenční analýze, což potvrdilo výsledky získané pomocí screeningového testu RhyMA Test-Herpes.

HSV-1 a CMV qRT-PCR.

celková RNA byla reverzní transkripcí pomocí RETRO-script kit (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) s náhodnými hexamerovými primery. cDNA byly testovány na kvalitu šablon konstrukcí standardních křivek pomocí sériových ředění každé cDNA jako šablon v qRT-PCR. Šablony cDNA dávaly účinnost testu 90% až 105% a R2 všech standardních křivek byl > 0.98. Po reverzní transkripci byly cDNA amplifikovány pomocí primerů specifických pro ICP0 a IE1 pro kvantifikaci mRNA HSV-1 a hcmv, jak bylo dříve popsáno. 9,10

všechny QRT-PCR byly provedeny ve trojím vyhotovení pomocí Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) v sekvenčním detektoru ABI PRISM 7500 (PE Biosystems, Foster City, Kanada), včetně extrahovaných vzorků RNA a pozitivních a negativních kontrol. SYBR Zelená fluorescence byla měřena v průběhu 40 amplifikačních cyklů. Pro každou kvantifikovanou šablonu bylo vypočteno průměrné číslo cyklu, při kterém akumulace produktu vstoupila do lineárního rozmezí (CT). Replikované hodnoty CT byly v rozmezí 0,4 cyklů od sebe. Na 18SrRNA CT hodnota pro danou šablonu byly odečteny od CT získané pro každý mRNA zájmu (ICP0 a IE1) ze stejné šablony k získání normalizované CT hodnota (ΔCT) pro každou šablonu.

exprese genu tumor nekrotizující faktor-α a Interleukin-6.

pro kvantifikaci mRNA TNF-α nebo IL-6 byl použit 1 µl cDNA společně s výše uvedenými primery při 20 µl reakci s použitím SYBR green jako markeru obsahu DNA. Použité primery byly: beta actin: Forward: 5′ – TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3′, Reverse: 5′ – TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Forward: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, Reverzní: 5′-GGC TGG GTA ROUBÍK AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Vpřed: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, Reverzní: 5′-GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3′. 12 Žádné vedlejší produkty byly přítomny v reakční jak je uvedeno disociace vzor uvedený na konci reakce a elektroforézou v agarózovém gelu (údaje nejsou uvedeny). Účinnost amplifikace produktů TNF-α a IL-6 byla stejná jako účinnost beta aktinu, jak je naznačeno standardními křivkami amplifikace, což nám umožňuje použít vzorec: násobné zvýšení = 2-(ΔCt A-ΔCtB). Reakce byly provedeny ve trojím vyhotovení, aby bylo možné statistické vyhodnocení.

Výsledky

PCR–reverzní hybridizace test byl zaměstnán na obrazovce pro DNA z osmi různých herpes viry v meziobratlové ploténky vzorky pacientů s herniace disku (Obr. 1). DNA herpesviru byla detekována u 13 ze 16 vzorků (81,25%). HSV-1 vykazoval nejvyšší prevalenci u devíti pacientů (56,25%), zatímco CMV byla zjištěna u šesti pacientů (37,5%) (tabulka I). Dva pacienti byli současně infikováni jak HSV-1, tak CMV. DNA z HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 a HHV8 nebyla detekována ve vzorcích disků žádného z pacientů. Ani jeden z kontrolních pacientů (C1 a C2) nebyl pozitivně testován na přítomnost DNA herpesviru (obr. 1).

stav infekce HSV-1 a CMV ve vzorcích meziobratlové ploténky byl zkoumán zkoumáním potenciální exprese virových transkriptů pomocí qRT-PCR v reálném čase. Herpes virus genové exprese nebyla detekována v žádném z testovaných vzorků, což dokazuje absence aktivní virové infekce, což naznačuje, ustavení latentní infekce herpesvirem v těchto vzorků.

byla také zkoumána séropozitivita pacientů. Všichni pacienti pozitivní na HSV-1 nebo CMV PCR vykazovali IgG + protilátky pro stejný virus (tabulka I). Ve třech případech pro HSV-1 a v šesti případech pro CMV byly detekovány IgG+ protilátky bez současné prevalence virové DNA. Kromě toho, HSV-1 a CMV IgM+ protilátky z periferní krve byly negativní u všech pacientů, což naznačuje, že žádný z pacientů prodělali akutní infekce virem herpes simplex v době chirurgické excize.

na Rozdíl od makroskopické označení zánětu v okolí herniated disk, jsme také získány experimentální důkazy o zánět meziobratlové ploténky exempláře tím, že zkoumá mRNA TNF-α a IL-6, ve všech vzorků pomocí zásahovou jednotku-PCR. Analýza ukázala přibližně dvojnásobné až trojnásobné zvýšení obou zánětlivých markerů ve vzorcích ve srovnání s kontrolami (obr. 2). Je zajímavé, že pacienti, kteří byli současně infikováni jak HSV-1, tak CMV, vykazovali nejvyšší hladiny TNF-α a IL-6. Dále dva ze tří pacientů (pacienti 2 a 8) bez známek virové infekce vykazovali nižší hladiny TNF-α. Tato negativní korelace nebyla u těchto pacientů zjištěna pro hladiny IL-6.

diskuse

tato studie naznačuje koncept, že infekce herpes virusem může podporovat degeneraci disku. Byli jsme schopni detekovat DNA HSV-1 a CMV ve velkém počtu vzorků lidských meziobratlových plotének odebraných během discektomie.

dřívější infekce nízkého stupně byla navržena jako možná příčina degenerace disku. 2,4 Několik autorů zdůraznili vztah mezi Modic 1. typu signálů (zvýšení kostní dřeně intenzitu signálu v T2 vážených MR obrazů a snížení intenzity signálu v T1-vážených MR obrazů a fibrovaskulární tkáně v endplates) a infekce. 13,14, Pokud pacienti nemají bolest v zádech, teploty, nebo abnormální krevní profil je obtížné rozlišit mezi Modic 1 změny a low-grade infekce. 13,14

vztah mezi virovou infekcí a apoptózy byl široce zkoumán, objasňující mechanismy indukce apoptózy viry. 15,16 nyní je známo, že Parvovirus B19 a zejména jeho NS-1 protein, má silný cytotoxický efekt na hostitelské buňky a způsobuje apoptózu v infikovaných buňkách. 17 viry hrají roli v patogenezi různých forem artritidy. 5 detekoval virovou DNA z více virů v synoviální tkáni odebranou od pacientů s časnou artritidou. Nedávná studie naznačila, že pokročilá stadia osteoartrózy mohou souviset se zvýšeným zánětem a poškozením kloubní chrupavky v důsledku parvoviru B19. 18 V další studii, to bylo navrhl, že lidský Parvovirus B19 je zapojen v zahájení a trvání synovitidy u revmatoidní artritidy, což vede ke společné léze v průběhu nadměrná syntéza zánětlivých cytokinů a proteolytických enzymů. 19

infekce HSV-1 jsou endemické po celém světě. Více než 90% dospělých má protilátky proti HSV-1 do páté dekády. Herpes viry jsou všudypřítomné patogeny u dětí, které zůstávají latentní po aktivní infekci. 20,21 během počáteční fáze infekce dochází k virové replikaci v gangliích s přežitím některých buněk, které udržují virový genom kompatibilní s normální buněčnou funkcí. Tato jemná rovnováha mezi hostitelskými buňkami a virem může být narušena různými podněty, což vede k reaktivaci. 22

v naší studii žádný z pacientů neměl akutní herpetickou infekci. To bylo patrné jak na sérologické úrovni, kvůli nepřítomnosti IgM+ protilátek z periferní krve, tak i na molekulární úrovni kvůli nedostatku virových mRNA transkriptů ze vzorků disků. Vysoká prevalence infekce HSV-1 v dětství, stejně jako její retence v nervovém systému, by tedy mohla nabídnout uspokojivé vysvětlení přítomnosti HSV-1 I CMV v intervertebrálním disku.

vyvstává otázka, jak viry vstupují do prostoru meziobratlové ploténky. Je dobře známo, že velké cévní kanály přes konec desky během časného fetálního života, které se následně klesá s narozením a zcela zmizí ve věku čtyři až šest let, což disku jednoho z největších avaskulární typů tkání v těle. 23 Jeden by mohl spekulovat, že přítomnost virové DNA v meziobratlové ploténky je sekundární migrace makrofágů nebo jiných buněk, které obsahují virovou DNA do disku během dětství, zatímco disk prostředí je stále bohatá na krevní cévy. Roli mohou hrát i další mechanismy, protože je dobře známo, že virus herpes simplex může být aktivován v neuronálních axonech zánětlivými cytokiny, jako je IL-1 a TNF-α 24,25, a prostřednictvím antidromální migrace může zahrnovat diskový prostor.

zanícený nebo zraněný disk, který produkuje řadu prozánětlivých cytokinů, aktivuje latentní viry. Tyto mechanismy by také mohly vysvětlit přítomnost DNA ze dvou nebo více virů ve vzorcích disků. I když přítomnost virů, je sekundární jev, jejich přítomnost může přispět k patogenezi degenerace meziobratlové ploténky od virových antigenů dále posílit disk zhoršení aktivací zánětlivé prostředí, které usnadňuje aktivuje makrofágy a další buňky, aby způsobit poškození tkáně.

v naší studii intraoperační hodnocení chirurgického pole odhalilo makroskopický důkaz zánětu obklopujícího herniovaný disk. Důkazy o zánět v disku vzorky a příspěvek virové infekce, k posílení zánětlivého procesu přišla z analýzy mRNA známých genů, které jsou spojeny se zánětem, jako jsou TNF-α a IL-6. Oba zánětlivé markery vykazovaly přibližně dvakrát až třikrát vyšší hladiny ve vzorcích pacientů ve srovnání s kontrolami. Zajímavé je, že vzorky, které byly nakažených oběma HSV-1 a CMV vykazoval nejvyšší hladiny TNF-α a IL-6, což naznačuje, že synergický účinek na viry. Kromě toho byly hladiny TNF-α stejně nízké jako kontrolní případy u pacientů, u kterých jsme nemohli detekovat virovou DNA.

nedávné recenzi článku uvádí, že disk degenerace není diagnóza, ale vyjádřením stavu disku, který je výsledkem několika faktorů, herectví, individuálně nebo kolektivně. 1 Spíše než výsledkem jednoho procesu, disk degenerace může mít řadu možných příčin, včetně mechanické, stárnutí, genetické, systémové, toxické a/nebo infekce. Absence virové detekce u všech našich 16 pacientů je v souladu s multifaktoriální příčinou prolapsu disku. Je známo, že genetické faktory produkují abnormální složek matrice 26-28 které narušují strukturu a funkci disku a zvýšit náchylnost disku tkáně na mechanický stres. 29 Epidemiologické studie ukázaly, že genetické faktory zvyšují riziko degenerace, 30-35 ale nemají účet pro všechny případy, 28,36 s variacemi různých etnických skupinách 37 taková, že velké multi-etnické populace studie jsou potřebné. 38

přítomnost virů na disku může vytvořit prostředí, kde je disk náchylný k poškození mechanickým namáháním a traumatem. Je pravděpodobné, že virová DNA by byla přítomna na úrovni meziobratlových plotének, ale mechanické namáhání, které se předpokládá, že přispívají k degeneraci, probíhá na lumbosakrální úrovni, kde jsou problémy mnohem častější. 1 Low-grade infekce, s nebo bez genetického vlivu, může zvýšit náchylnost meziobratlové ploténky faktory životního prostředí, které sekundárně řídit biologické události, což vede k degenerace plotének. Možná herpes DNA, působí jako faktor, který ovlivňuje strukturální charakteristiky matrice, v disku modulací apoptózy a místní zánětlivé reakce, což naznačuje, že virová infekce nebo reaktivace je spojena s nemocí.

objev Marshalla a Warrena 39, že infekce Helicobacter pylori byla zodpovědná za vývoj žaludečních vředů, vedla k významnému posunu v lékařském porozumění. Možnost, že infekční proces může přispět k degeneraci disku, by měla být zvážena vážně.

věříme, že se jedná o první studii dokumentující přítomnost herpetických virů v meziobratlové ploténce pacientů s herniací disku. Další studie jsou nezbytné k určení základních mechanismů a podpoře potenciální role herpetických virů v patogenezi degenerativního onemocnění disku.

Žádné výhody v jakékoli formě byly přijaty nebo budou přijaty od komerční párty, související přímo nebo nepřímo s předmětem tohoto článku.