TEXT

Viry zkušenosti zcela odlišné prostředí, v závislosti na tom, zda jsou replikace uvnitř hostitelské buňky, nebo v tranzitu z jednoho hostitele na druhého. V buňce jsou virové a virové složky vystaveny redukčnímu prostředí, kde je redoxní potenciál určen primárně glutathionem (18). V kontrastu, mimo buňku, virus je vystavena kyslíku a toxických produktů odvozených od kyslíku, jako je peroxid vodíku, superoxid a hydroxylový radikál, reaktivní druhy, které mají potenciál k inaktivaci viru. Vyrovnat se s tak vysoce reaktivní sloučeniny, rostliny a zvířata express enzymy schopen převést je na netoxické produkty. Příklady takových enzymů jsou kataláza, peroxidázy a superoxiddismutáza (28). Zde popisujeme výsledky studií, které prokazují přítomnost katalázy uvnitř purifikovaného herpes simplex virion. Poté byly provedeny testy, aby se zjistilo, zda vnitřní kataláza může chránit virus před inaktivací H2O2.

byly provedeny studie katalázy s virem herpes simplex 1 (HSV-1), který byl pěstován na buňkách Vero v kultuře a purifikován centrifugací s gradientem hustoty sacharózy. Když byly suspenze viru upraveny na 1% H2O2, začaly se rychle vytvářet bubliny kyslíku, což naznačuje přítomnost katalázy (obr. 1a, levá trubka). Bubliny zřejmé, vizuálně po několika sekundách inkubace při pokojové teplotě a pokračoval k formě a zvětšit alespoň 20 min. Žádné bubliny se však nevytvořily, pokud byl inhibitor katalázy azid sodný přidán do virové suspenze před léčbou H2O2 (obr. 1a, vpravo). Testy byly také negativní, když (i) virus byl odstraněn z roztoku pomocí centrifugace před přidáním H2O2 nebo (ii) HSV-1 capsids (B capsids) byly nahrazeny pro intaktní virus. V podobných testech nebyly u purifikovaného viru vezikulární stomatitidy nebo lidského adenoviru 2 pozorovány bubliny indikující přítomnost katalázy (údaje nejsou uvedeny). Analýza Western blot potvrdila přítomnost katalázy spojené s virem HSV-1, ale ne s adenovirem, virem vezikulární stomatitidy (VSV) nebo kapsidy HSV-1 A (obr. 1b).

Identifikace HSV-1-asociovaný enzym kataláza testu (a), Western blot analýzou (b), a sacharóza hustota přechodu odstředění (c). Panel a ukazuje trubice obsahující purifikovaný HSV-1 20 min po řešení byla upravena na 1% H2O2 (levá trubka) a podobné inkubace, na které kataláza inhibitor (2 mM azid sodný) bylo přidáno před H2O2 (vpravo). Všimněte si tvorby bublin v levé trubici, což naznačuje přítomnost katalázy ve viru. Koncentrace viru byla 0,25 mg / ml v TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 m NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) A inkubace byla při pokojové teplotě. Virus byl KOS kmenem HSV-1, která byla pěstována na jednovrstvé kulturách Vero buňky a čistí sacharóza hustota přechodu odstředění, a titr byl určen koncový bod ředění, jak je popsáno výše (14). Panel b ukazuje výsledky Western blot test na přítomnost katalasy v HSV-1, human adenovirus 2 (HAd2), virus vezikulární stomatitidy (VSV), a HSV-1 A capsids. Lidský adenovirus 2 a virus vezikulární stomatitidy (Indiana; Kmen San Juan) byly pěstovány na jednovrstvých kulturách buněk HeLa a Vero a čištěny dříve popsanými postupy (12, 17). Publikované metody byly také použity pro čištění kapsidů HSV-1 A A B (23). Hlavní kapsidový proteiny byly detekovány pomocí barvení blotu s 1% Ponceau S (horní řada), zatímco katalasy byla zjištěna immunostaining s protilátka specifická pro katalázu (Calbiochem; králičí polyklonální 219010; 1:5,000 ředění) (15). Všimněte si, že kataláza byla detekována ve viru HSV-1, ale ne HAd2, VSV nebo HSV-1 a kapsidy. Panel c ukazuje výsledky analýzy gradientu hustoty sacharózy. Celkem 50 µg purifikovaného HSV-1 v 50 µl TNE bylo centrifugováno na 600 µl gradientu 20% až 50% sacharózy v TNE. Centrifugace byla za 45 min na 22.000 ot / min v Beckman SW55 rotoru při 4°C. gradient byl frakcionaci, a jednotlivé frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE následovaná blotting na polyvinylidene difluoride (PVDF) a barvení s 1% Ponceau S. blot byl pak destained a potřísněné protilátka specifická pro katalázu (který se stěhoval shodou okolností se standardní katalázu; Worthington LS001872). Všimněte si, že poloha viru v gradientu (horní řádek) se shoduje s polohou katalázy (spodní řádek), což naznačuje, že tyto dva jsou spojeny.

byly provedeny kontrolní experimenty s cílem potvrdit, že kataláza je spojena s HSV-1 a ne s nečistotami přítomnými v přípravku viru. Čistí HSV-1 se odstředí do kapely na sacharóza hustota gradient, gradient byl frakcionaci, a Western blot analýzu byla použita k testování jednotlivých gradient frakce na přítomnost katalasy. Výsledky ukázaly, že kataláza byla přítomna ve frakcích obsahujících virus, ale ne v sousedních frakcích (obr. 1c). Výsledky jsou interpretovány tak, že naznačují, že kataláza je spojena s HSV-1 a ne s kontaminanty, jako jsou bakterie obsahující katalázu nebo materiály hostitelských buněk v přípravku viru. Protože genom HSV-1 nekóduje katalázu (22), musí být enzym spojený s virem odvozen z hostitelské buňky. Časné studie viru vaccinia prokázaly přítomnost katalázy uvnitř zralého virionu (8). Kromě tohoto pozorování nevíme o žádné jiné zprávě o kataláze jako součásti virové struktury.

další analýza katalázy spojené s HSV-1 byla zaměřena na stanovení umístění enzymu ve virionu. Byly provedeny dva typy experimentů. První, čištěná virus byl léčen s proteolytický enzym pronase degradovat virus glykoproteiny a proteiny nejsou obsaženy v virion membrány. Očekávalo se, že vnitřní virové proteiny nebudou ovlivněny, protože pronáza neprochází virovou lipidovou dvojvrstvou (16). Po ošetření pronázou byl virus sklizen centrifugací a rozsah ztráty katalázy byl stanoven analýzou Western blot. Výsledky neprokázaly ztrátu katalázy ve dvou koncentracích testovaných virů (viz katalázové pásmo na obr. 2a, pruhy 1 a 2). Interní kontroly prokázaly, že povrchové glykoproteiny viru gB a gH byly štěpeny podle očekávání (obr. 2a; porovnat pruhy 2 a 3). Podobně analýza Western blot prokázala, že HSV-1 glykoprotein D byl tráven pronázou nebo trypsinem za podmínek, kdy nebyla ovlivněna kataláza (obr. 2b). Purifikovaná kataláza v roztoku byla také trávena za stejných podmínek. V kontrastu, žádná degradace vnitřních slupek (UL47, UL48, a UL49) nebo proteinů kapsidový (UL19, UL38, UL18; Obr. 2a, pruhy 1 a 2) byly pozorovány. Výsledky jsou interpretovány tak, aby naznačovaly, že kataláza je umístěna uvnitř obálky HSV-1.

Lokalizace katalasy v HSV-1 ošetření čistí virionů s pronase (dráhy 1 až 3) a Triton X-100 (a, pruhy, 4 a 5) a tím pronase a trypsin léčba (b, dráhy 1 až 3). Panel a ukazuje, SDS-PAGE a Western blot analýzy proteinů přítomných v neporušené HSV-1 (dráhy 3 a 4) a v virionů po léčbě s pronase (dráhy 1 a 2) a Triton X-100 (lane 5). Všimněte si, že katalasy byla zjištěna přítomnost v neporušené virionů (dráhy 3 a 4) a v pronase léčených virionů (dráhy 1 a 2), ale ne v virionů po léčbě s 1% Triton X-100 (lane 5). Pronase léčba byla provedena trávením čištěná HSV-1 (0,25 mg/ml) s 1 mg/ml pronase (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) po dobu 4 h při teplotě 37°C. Po pronase léčba, virus byl reisolated tím, sacharóza hustota přechodu odstředění před SDS-PAGE a Western blot analýzy. Triton X-100 byla provedena léčba úpravou purifikovaný virus 1% Triton X-100 v TNE pufru obsahujícího 10 mM dithiothreitolu (DTT) a inkubací po dobu 15 min na led (4°C). Výsledné kapsidy byly poté vyčištěny centrifugací sacharosového gradientu před analýzou SDS-PAGE a Western blot. b) Western blot analýza purifikovaného HSV-1 po léčbě in vitro pronázou nebo trypsinem. Celkem 100 µl purifikovaného HSV-1 (1 mg / ml)bylo upraveno na pronázu 2 mg/ml nebo trypsin 2 mg / ml. Kontrolní inkubace neměla žádný enzym. Směsi byly inkubovány po dobu 2 h při 37°C, a virionů byly čištěny od enzymů centrifugace na 20% do 50% sacharózy gradient, jak je popsáno v legendě na Obr. 1. Vzorky viru byly peletovány centrifugací a vyšetřeny analýzou SDS-PAGE a Western blot. Bloty byly obarveny na katalázu (králičí polyklonální; viz výše) a glykoprotein D (myší monoklonální protilátka DL11; dárek od Gary Cohen a Roselyn Eisenberg; 1:5,000). Všimněte si, že léčba proteázou způsobila trávení glykoproteinu D, ale ne katalázy, což naznačuje, že kataláza je umístěna uvnitř membrány HSV-1.

přesnější definice umístění katalázy byla získána zpracováním purifikovaného viru neiontovým detergentem Triton X-100 (TX-100). Když se provádí s čerstvým virus, tato léčba způsobuje ztrátu virus membrány, membránové glykoproteiny, a téměř všechny 20 nebo více slupek proteiny (všechny ale UL36, UL37, a US3) (13, 21, 27). Kapsida si však zachovává svou integritu a žádný z hlavních kapsidových proteinů se neztratí. DNA viru je zachována uvnitř kapsidy. Experimenty zahrnovaly ošetření HSV-1 1% TX-100 a izolaci výsledných kapsidů centrifugací s gradientem hustoty sacharózy. Analýza Western blot byla poté použita k testování kapsidů na přítomnost katalázy. Výsledky prokázaly, že virové glykoproteiny a tegumentové proteiny byly odstraněny podle očekávání a že byla odstraněna také kataláza (viz obr. 2a, pruhy 4 a 5). Tento experiment je interpretován tak, že naznačuje, že kataláza je přítomna v tegumentu HSV-1.

informace, jako je znázorněno na obr. 2 lze použít ke stanovení počtu molekul katalázy na HSV-1 virion (15). Toto měření bylo provedeno počínaje dvěma identickými alikvoty vyčištěného viru. Dva byly použity pro stanovení (i) počet hlavní kapsidový protein molekuly (UL19) z Coomassie blue-barevného gelu a (ii) počtu 60-kDa kataláza molekuly z kalibrované Western blot. V reprezentativním stanovení tato analýza poskytla hodnotu 1: 207,5 pro molární poměr katalázy k UL19. Protože existuje 955 ul19 molekul na kapsidu HSV-1, byl počet molekul katalázy na kapsidu stanoven na 955/207. 5 nebo 4.6. Druhé podobné stanovení přineslo hodnotu 7,1 molekul katalázy. Protože v aktivní molekule katalázy (11, 20) jsou čtyři podjednotky 60-kDa, výsledky naznačují přítomnost 1 až 2 tetramerů katalázy na virion.

přítomnost katalázy uvnitř virionu HSV-1 naznačuje možnost, že se může podílet na ochraně viru před oxidačním poškozením H2O2. Alternativně, kataláza, může být pasivně začleněna do HSV-1 jako osemení je přidán do cytoplazmy hostitelské buňky a nemá žádnou ochrannou funkci. Abychom rozlišili mezi těmito dvěma možnostmi, zkoumali jsme citlivost purifikovaného HSV-1 na inaktivaci H2O2in vitro. HSV-1 byl léčen H2O2 v přítomnosti nebo nepřítomnosti inhibitoru katalázy azidu sodného (NaN3) a titr viru byl poté stanoven (v nepřítomnosti inhibitoru katalázy). Výsledky ukázaly, že zatímco 50 mM H2O2 produkoval mírný pokles v titru (3 – až 4-násobné), smrtící účinek 106-krát nebo větší, byla pozorována, pokud NaN3 byl přítomen (Tabulka 1). Kontrolní experimenty ukázaly malé zabíjení HSV-1 samotným NaN3 (Tabulka 1). Výsledky jsou interpretovány tak, že naznačují, že kataláza poskytuje významnou úroveň ochrany proti inaktivaci HSV-1 H2O2.

neočekává se, že by HSV-1 musel být chráněn před oxidačním poškozením H2O2, zatímco je spojen s hostitelskou buňkou. Jak je popsáno výše, v buňce se nachází redukční prostředí, které by zabránilo tvorbě H2O2. Mimo hostitelskou buňku je však prostředí oxidační, schopné produkovat H2O2 jak uvnitř viru, tak v okolním médiu. HSV-1 by se setkal s tímto prostředím, protože je přenášen z jednoho hostitele na druhého, a kataláza může být zapojena do ochrany infekčnosti HSV-1 během tranzitu. Kataláza spojená s HSV-1 může také poskytovat ochranu před H2O2 produkovaným komenzálními bakteriemi nebo jinými zdroji. Bylo například prokázáno, že H2O2 produkovaný laktobacily chrání ženský pohlavní trakt před onemocněním způsobeným mikrobiální infekcí (4). Vzhledem ke své vysoké katalytické rychlosti by kataláza spojená s virem mohla hrát roli v ochraně HSV-1 navzdory nízkému počtu kopií (1 až 2 kopie na virion). Například jaterní kataláza je schopna detoxikovat desítky milionů molekul H2O2 za sekundu, mezi nejvyšší katalytické rychlosti hlášené pro jakýkoli enzym (2).

Všechny viry, herpes rodina slupek, vrstva bílkovin, která se nachází mezi virus capsid a membrány (5, 6, 9, 13). HSV-1 osemení je 40 až 50 nm, tloušťka a skládá se z přibližně 20 různých druhů bílkovin, z nichž téměř všechny jsou kódovány v genomu viru. Osemení bílkoviny se podstatně liší v jejich hojnosti v virion s 800 výtisků nebo více významných druhů, jako UL47, UL48, a UL49 (viz Obr. 2a, pruh 3) (5, 16). Mnoho tegumentových proteinů se podílí na raných krocích replikace HSV-1, jako je aktivace časné transkripce genů a útlum syntézy proteinů hostitelských buněk (13, 24, 25). Osemení je sestaven do rodící se HSV-1 virion jako DNA obsahující kapsidový pupeny do váčku z trans-Golgiho síť (10). To je navrhl, že kataláza je začleněna spolu s dalšími slupek proteinů během začínajícího procesu.

v neinfikovaných buňkách se většina katalázy nachází v peroxizomech (26). Aby mohla být začleněna do potomstva HSV-1 během tegumentace, jak je popsáno výše, kataláza by musela být uvolněna z peroxizomů. Předpokládáme, že k tomu může dojít v důsledku rozsáhlého přeskupení cytoplazmatických membrán, které doprovází replikaci HSV-1 (1).

Palamara et al. (19) prokázali, že ke snížení koncentrace cytoplazmatického glutathionu dochází okamžitě poté, co jsou buňky Vero infikovány HSV-1. Očekává se, že snížení koncentrace glutathionu způsobí snížení cytosolického redukčního potenciálu a zdá se, že toto snížení potencuje replikaci HSV-1. Bylo zjištěno, že Extra glutathion poskytovaný v růstovém médiu antagonizuje růst HSV-1 (19). Stejně jako externě přidaný glutathion může cytosolická kataláza zvýšit redukční potenciál cytoplazmy odstraněním H2O2. Navrhuje se proto, že jedním z důsledků inkorporace katalázy do virionů potomstva může být zesílení růstu viru tím, že se infikované buňky zbaví katalázy.

malý počet molekul katalázy na virion může vysvětlit, proč nebyl detekován hmotnostní spektrometrickou analýzou celých virionů HSV-1 (7). Existuje několik high-copy-počet HSV-1 virion proteiny, které by mohly zakrýt signál z kataláza (například, tam jsou tisíce kopií glykoproteinové molekuly a 955 kopie hlavního kapsidového proteinu ). Množství katalázy nesplňuje neformální norma pro detekci hmotnostní spektrometrií (viditelnost na Coomassie-barevné SDS-PAGE gelu). Peroxiredoxin, peroxizomální protein s antioxidační aktivitou, byl detekován v hmotnostní spektrometrické analýze HSV-1 (7, 26).

v budoucnu může být možné využít citlivost HSV-1 na cytotoxické účinky H2O2. Očekává se, že virus by byl obzvláště zranitelný, pokud je v oxidačním prostředí mimo hostitelskou buňku a pokud je kataláza inhibována.