TEXT

virus upplever helt olika miljöer beroende på om de replikerar inuti en värdcell eller i transit från en värd till en annan. Inom en cell utsätts viruset och viruskomponenterna för en reducerande miljö, där redoxpotentialen bestäms främst av glutation (18). Däremot utsätts viruset utanför en cell för syre och giftiga produkter härrörande från syre, såsom väteperoxid, superoxid och hydroxylradikal, reaktiva arter som har potential att inaktivera viruset. För att klara sådana mycket reaktiva föreningar uttrycker växter och djur enzymer som kan omvandla dem till icke-toxiska produkter. Exempel på sådana enzymer är katalas, peroxidaser och superoxiddismutas (28). Här beskriver vi resultaten av studier som visar närvaron av katalas inuti den renade herpes simplex virion. Tester utfördes sedan för att avgöra om internt katalas kunde skydda viruset från inaktivering av H2O2.

studier av katalas utfördes med herpes simplex virus 1 (HSV-1) som odlades på Vero-celler i odling och renades genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering. När virussuspensioner justerades till 1% H2O2 började syrebubblor bildas omedelbart, vilket indikerar närvaron av katalas (Fig. 1A, vänster rör). Bubblor blev synliga visuellt efter några sekunders inkubation vid rumstemperatur och fortsatte att bildas och förstoras i minst 20 min. Inga bubblor bildades emellertid om katalashämmaren natriumazid tillsattes till virussuspensionen före H2O2-behandling (Fig. 1a, höger). Analyser var också negativa när (i) viruset avlägsnades från lösningen genom centrifugering före tillsats av H2O2 eller (ii) HSV-1 capsids (B capsids) ersattes med intakt virus. I liknande analyser observerades inte bubblor som indikerar närvaron av katalas med renat vesikulärt stomatitvirus eller humant adenovirus 2 (data visas inte). Western blot-analys bekräftade närvaron av katalas associerat med HSV-1-virus men inte med adenovirus, vesikulärt stomatitvirus (VSV) eller HSV-1 A capsids (Fig. 1b).

identifiering av HSV-1-associerat katalas genom enzymanalys (a), Western blot-analys (b) och sackarosdensitetsgradientcentrifugering (c). Panel A visar ett rör innehållande renat HSV-1 20 min efter att lösningen justerades till 1% H2O2 (vänster rör) och en liknande inkubation till vilken en katalashämmare (2 mM natriumazid) tillsattes före H2O2 (höger). Observera bildandet av bubblor i det vänstra röret, vilket indikerar närvaron av katalas i viruset. Viruskoncentrationen var 0,25 mg / ml i TNE (0,01 m Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) och inkubation var vid rumstemperatur. Viruset var Kos-stammen av HSV-1, som odlades på monolagskulturer av Vero-celler och renades genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering, och titern bestämdes genom slutpunktsutspädning som tidigare beskrivits (14). Panel b visar resultaten av ett Western blot-test för närvaron av katalas i HSV-1, humant adenovirus 2 (HAd2), vesikulärt stomatitvirus (VSV) och HSV-1 A-kapsider. Humant adenovirus 2 och vesikulärt stomatitvirus (Indiana; San Juan stam) odlades på monolayer kulturer av HeLa och Vero celler, respektive, och renas genom tidigare beskrivna förfaranden (12, 17). Publicerade metoder användes också för rening av HSV-1 A och B capsids (23). Huvudkapsid proteiner detekterades genom färgning av blot med 1% Ponceau S (Övre raden), medan katalas detekterades genom immunfärgning med antikroppsspecifik för katalas (Calbiochem; kanin polyklonal 219010; 1:5000 utspädning) (15). Observera att katalas upptäcktes i HSV-1-virus men inte HAd2, VSV eller HSV-1 A capsids. Panel c visar resultaten av sackarosdensitetsgradientanalys. Totalt centrifugerades 50 CG renat HSV-1 i 50 CGR TNE på en 600-CGR-gradient på 20% till 50% sackaros i TNE. Centrifugering var i 45 minuter vid 22 000 rpm i en Beckman SW55-rotor vid 4 CCG. gradienten fraktionerades och individuella fraktioner analyserades med SDS-sida följt av blottning på polyvinylidendifluorid (PVDF) och färgning med 1% Ponceau S. blot destainerades sedan och färgades med antikroppsspecifik för katalas (som migrerade samtidigt med standardkatalas; Worthington LS001872). Observera att virusets position i gradienten (översta raden) sammanfaller med katalas (nedre raden), vilket tyder på att de två är associerade.

kontrollförsök utfördes för att bekräfta att katalas var associerat med HSV-1 och inte med föroreningar närvarande i virusberedningen. Renad HSV-1 centrifugerades till ett band på en sackarosdensitetsgradient, gradienten fraktionerades och Western blot-analys användes för att testa individuella gradientfraktioner för närvaron av katalas. Resultaten visade att katalas var närvarande i virusinnehållande fraktioner men inte i flankerande (Fig. 1c). Resultaten tolkas för att indikera att katalas är associerat med HSV-1 och inte med föroreningar, såsom katalasinnehållande bakterier eller värdcellmaterial i virusberedningen. Eftersom HSV-1-genomet inte kodar för katalas (22) måste det virusassocierade enzymet härledas från värdcellen. Tidiga studier av vacciniavirus visade närvaron av katalas inuti den mogna virionen (8). Bortsett från denna observation känner vi inte till någon annan rapport om katalas som en komponent i en virusstruktur.

ytterligare analys av HSV-1-associerat katalas syftade till att bestämma placeringen av enzymet i virionen. Två typer av experiment gjordes. Först behandlades renat virus med det proteolytiska enzympronaset för att bryta ner virusglykoproteinerna och eventuella proteiner som inte finns i virionmembranet. Interna virala proteiner förväntades inte påverkas, eftersom pronas inte korsar viruslipidbilayer (16). Efter pronasbehandling skördades viruset genom centrifugering och omfattningen av katalasförlust bestämdes genom Western blot-analys. Resultaten visade inga tecken på katalasförlust i två koncentrationer av testade virus (se katalasbandet i Fig. 2A, körfält 1 och 2). Interna kontroller visade att virusytan glykoproteiner gB och gH klyvdes som förväntat (Fig. 2A; jämför körfält 2 och 3). På liknande sätt visade Western blot-analys att HSV-1 glykoprotein D smältes av pronas eller trypsin under förhållanden där katalas inte påverkades (Fig. 2b). Renat katalas i lösning smältes också under samma betingelser. Däremot ingen nedbrytning av internt tegument (UL47, UL48 och UL49) eller kapsid proteiner (UL19, UL38, UL18; Fig. 2A, körfält 1 och 2) observerades. Resultaten tolkas för att indikera att katalas ligger inuti HSV-1-kuvertet.

lokalisering av katalas i HSV-1 genom behandling av renade virioner med pronas (körfält 1 till 3) och Triton X-100 (a, körfält 4 och 5) och genom pronas-och trypsinbehandling (B, körfält 1 till 3). Panel A visar SDS-PAGE och Western blot-analys av proteiner som finns i intakt HSV-1 (körfält 3 och 4) och i virioner efter behandling med pronas (körfält 1 och 2) och Triton X-100 (körfält 5). Observera att katalas befanns vara närvarande i intakta virioner (körfält 3 och 4) och i pronasbehandlade virioner (körfält 1 och 2) men inte i virioner efter behandling med 1% Triton X-100 (körfält 5). Pronasbehandling utfördes genom att smälta renat HSV-1 (0,25 mg/ml) med 1 mg/ml pronas (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) under 4 timmar vid 37 C. Efter pronasbehandling återupptogs viruset genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering före SDS-PAGE och Western blot-analys. Triton X – 100-behandling utfördes genom att justera renat virus till 1% Triton X-100 i TNE-buffert innehållande 10 mM ditiotreitol (DTT) och inkubera i 15 minuter på is (4 CCR). De resulterande kapsiderna renades sedan genom sackarosgradientcentrifugering före SDS-PAGE och Western blot-analys. (b) Western blot-analys av renat HSV-1 efter behandling in vitro med pronas eller trypsin. Totalt justerades 100 ci l renat HSV-1 (1 mg/ml) till 2 mg/ml pronas eller 2 mg/ml trypsin. En kontrollinkubation hade inget enzym. Blandningar inkuberades i 2 timmar vid 37 CCI, och virioner renades bort från enzymer genom centrifugering på en 20% till 50% sackarosgradient som beskrivs i legenden till Fig. 1. Virusprover pelleterades genom centrifugering och undersöktes med SDS-PAGE och Western blot-analys. Blottar färgades för katalas (kanin polyklonal; se ovan) och glykoprotein D (mus monoklonal antikropp DL11; en gåva från Gary Cohen och Roselyn Eisenberg; 1:5000). Observera att proteasbehandling orsakade digestion av glykoprotein D, men inte katalas, vilket indikerar att katalas är beläget inuti HSV-1-membranet.

en mer exakt definition för placeringen av katalas erhölls genom behandling av renat virus med det nonjoniska tvättmedlet Triton X-100 (TX-100). När den utförs med färskt virus orsakar denna behandling förlust av virusmembranet, membranglykoproteinerna och nästan alla 20 eller fler tegumentproteiner (alla utom UL36, UL37 och US3) (13, 21, 27). Kapsiden behåller dock sin integritet och ingen av de viktigaste kapsid-proteinerna går förlorade. Virus-DNA behålls inuti kapsiden. Experiment involverade behandling av HSV-1 med 1% TX-100 och isolering av de resulterande kapsiderna genom sackarosdensitetsgradientcentrifugering. Western blot-analys användes sedan för att testa kapsiderna för närvaron av katalas. Resultaten visade att virusglykoproteinerna och tegumentproteinerna avlägsnades som förväntat och att katalas också avlägsnades (se Fig. 2A, körfält 4 och 5). Detta experiment tolkas för att indikera att katalas är närvarande i HSV-1-tegumentet.

Information som den som visas i Fig. 2 kan användas för att bestämma antalet katalasmolekyler per HSV-1 virion (15). Denna mätning utfördes med början med två identiska alikvoter av renat virus. De två användes för bestämning av (i) antalet huvudkapsid proteinmolekyler (UL19) från en Coomassie blåfärgad gel och (ii) antalet 60-kDa katalasmolekyler från en kalibrerad Western blot. I en representativ bestämning gav denna analys ett värde av 1: 207, 5 för det molära förhållandet katalas till UL19. Eftersom det finns 955 UL19-molekyler per HSV-1-kapsid bestämdes antalet katalasmolekyler per kapsid att vara 955/207.5 eller 4.6. En andra liknande bestämning gav ett värde av 7,1 katalasmolekyler. Eftersom det finns fyra 60-kDa-underenheter i en aktiv katalasmolekyl (11, 20) indikerar resultaten närvaron av 1 till 2 katalastetramerer per virion.

närvaron av katalas inuti HSV-1 virion föreslår möjligheten att det kan vara involverat i skydd av viruset från oxidativ skada av H2O2. Alternativt kan katalas passivt införlivas i HSV-1 eftersom tegumentet tillsätts i värdcellens cytoplasma och inte har någon skyddande funktion. För att skilja mellan de två möjligheterna undersökte vi känsligheten hos renad HSV-1 för inaktivering av H2O2in vitro. HSV-1 behandlades med H2O2 i närvaro eller frånvaro av katalashämmaren natriumazid (NaN3), och virustitern bestämdes därefter (i frånvaro av katalashämmare). Resultaten visade att medan 50 mM H2O2 gav en blygsam minskning av titer (3 – till 4-faldig), observerades en dödlig effekt av 106-faldig eller större om NaN3 var närvarande (Tabell 1). Kontrollexperiment visade lite dödande av HSV-1 av NaN3 ensam (Tabell 1). Resultaten tolkas för att indikera att katalas ger en betydande skyddsnivå mot inaktivering av HSV-1 av H2O2.