Bandscheibendegeneration ist eine häufige Erkrankung mit einer komplexen multifaktoriellen Ätiologie. 1 Eine niedriggradige Infektion wurde als Ursache für eine Bandscheibendegeneration mit Propionibacterium acne vorgeschlagen, die bei 84% der Patienten mit Bandscheibenvorfall und Ischias unter Verwendung von Serologie und Kulturen identifiziert wurde. 2 Molekulare Veränderungen wurden ebenfalls beobachtet, wie die erhöhte Produktion von katabolen Enzymen (Cathepsin, Lysozym und mehreren Matrix-Metalloproteinasen) und entzündlichen Zytokinen. 3 Junge Patienten mit Bandscheibenvorfall zeigten eine schlechtere Genesung nach der Operation, wenn sie präoperativ erhöhte Serumkonzentrationen von hochempfindlichem C-reaktivem Protein (hs-CRP) aufwiesen. Es ist jedoch nicht klar, ob hohe CRP- und inflammatorische Zytokine auf eine lokale Infektion oder eine entzündliche Reaktion auf einen Bandscheibenvorfall hinweisen. 4

Krankheitserreger wie das Parvovirus B19 oder das Epstein-Barr-Virus (EBV) spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese verschiedener Formen von Arthritis. 5,6 Herpesviren sind eine vielfältige Familie großer DNA-Viren, die alle lebenslange latente Infektionen hervorrufen können. Eine Primärinfektion mit vielen dieser Viren ist in der Kindheit häufig. 7,8

Ziel dieser Studie war es, die mögliche Rolle von Herpesviren, Herpes-Simplex-Virus Typ 1(HSV-1), Herpes-Simplex-Virus Typ 2 (HSV-2) und Cytomegalovirus (CMV) bei der Pathogenese der Bandscheibendegeneration zu untersuchen. Eine molekulare Analyse von Bandscheibenproben, die während der Diskektomie erhalten wurden, zeigte eine beträchtliche Häufigkeit von CMV- und HSV-1-DNA in degenerierten Bandscheiben, was darauf hindeutet, dass Virusinfektionen ein wichtiger Faktor für die Ätiologie dieser Krankheit sein könnten.

Patienten und Methoden

Insgesamt wurden 16 aufeinanderfolgende Patienten untersucht, die sich innerhalb von sechs Monaten nach einem Bandscheibenvorfall einer Diskektomie unterzogen. Es gab acht Männer und acht Frauen mit einem Durchschnittsalter von 40,38 Jahren (17 bis 65). Die Studie hatte ethische Zustimmung. Die Diagnose eines Bandscheibenvorfalls wurde durch körperliche Untersuchung und MRT gestellt. Um eine Kontrollgruppe bereitzustellen, wurden Blutproben perkutan von zwei Patienten mit thorakolumbalen Burstfrakturen erhalten, die operiert wurden. Diese Patienten wurden auch präoperativ einer MRT-Untersuchung unterzogen, um eine begleitende Degeneration auszuschließen. Die Art der in dieser Studie getesteten Proben erlaubte aus ethischen Gründen nicht die Aufnahme von mehr Bandscheiben von gesunden Personen, während die Alternative von Leichenproben als Kontrollen aufgegeben wurde, da die Mehrheit der erwachsenen Bevölkerung eine Vorgeschichte von Rückenschmerzen und Bandscheibendegeneration hat.

Zusätzlich zu dem Material aus dem Bandscheibenvorfall, das während der Diskektomie erhalten wurde, wurde jedem Patienten eine periphere Blutprobe entnommen. Gewebeproben wurden in sterilisiertes Polypropylen 1 gegeben.5 ml Röhrchen und bei -80°C gelagert, bis DNA/RNA-Extraktion und Polymerasekettenreaktion/quantitative Polymerasekettenreaktion (PCR/qRT-PCR) durchgeführt wurden. Der Nachweis von HSV-1- und CMV-, IgM + – und IgG + -Antikörpern aus dem Plasma wurde unter Verwendung eines Standard-Enzymimmunoassays durchgeführt.

DNA/RNA-Extraktion.

Aus den Gewebeproben wurden mit dem NucleoSpin Tissue XS Kit und dem NucleoSpin RNA XS kit (Macherey-Nagel GmbH and Co. Kg)genomische DNA und Gesamt-RNA extrahiert., Düren, Deutschland) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die gereinigte RNA wurde weiter mit DNaseI behandelt, um eine DNA-Kontamination zu vermeiden. DNA- und RNA-Probenkonzentrationen wurden vor der PCR-Amplifikation oder qRT-PCR mit einem Spektralphotometer (260 nm) bestimmt.

Nachweis von Herpesviren-DNA.

Wir testeten acht verschiedene Herpesviren (HSV-1/-2, Varicella-Zoster-Virus (VZV), EBV, CMV, Humane Herpesviren 6, 7 und 8 (HHV6, HHV7 und HHV8)) mittels RhyMA Test-Herpes Screening nach Herstellerangaben (Euroclone, Pavia, Italien). Der RhyMA-Test basierte auf der Reverse-Hybridisierungstechnologie mit Multiplex-DNA-Amplifikation durch PCR mit spezifischen biotinylierten Primern, gefolgt von der Hybridisierung der amplifizierten und biotinylierten DNA-Fragmente mit Streifen auf Sonden, die für jedes Herpesvirus spezifisch sind. Eine abschließende Entwicklungsreaktion unter Verwendung eines Biotin-Streptavidin-Systems war für die Auswertung der Ergebnisse erforderlich. Positiv- und Amplifikationskontrollen waren ebenfalls in jedem Streifen enthalten. Zur Interpretation der Ergebnisse wurde der entwickelte Streifen jeder Probe mit einer Standardtabelle abgeglichen. Das RhyMA Test-Herpes Screening ist für die In-vitro-Diagnostik zugelassen und bescheinigt die hohe Spezifität und Sensitivität des Assays. Um die mit dem RhyMA Test-Herpes Screening Assay erhaltenen Ergebnisse zu verifizieren, wurden die PCR-Produkte auch in einem 3% igen niedrigschmelzenden Agarosegel ausgeführt, das das erwartete elektrophoretische Muster für jedes Virus erzeugte. Schließlich wurden die PCR-positiven Proben einer direkten Sequenzierungsanalyse unterzogen, wodurch die mit dem RhyMA-Test-Herpes-Screening-Assay erhaltenen Ergebnisse bestätigt wurden.

HSV-1 und CMV qRT-PCR.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RETRO-script Kit (Ambion Inc., Austin, Texas, USA) mit zufälligen Hexamer-Primern. cDNAs wurden auf Template-Qualität getestet, indem Standardkurven unter Verwendung serieller Verdünnungen jeder cDNA als Template in qRT-PCRs erstellt wurden. Die cDNA-Templates ergaben eine Assay-Effizienz von 90% bis 105%, und der R2 aller Standardkurven betrug > 0,98. Nach der reversen Transkription wurden cDNAs unter Verwendung von ICP0- und IE1-spezifischen Primern zur Quantifizierung von HSV-1- bzw. HCMV-mRNAs amplifiziert, wie zuvor beschrieben. 9,10

Alle qRT-PCRs wurden in dreifacher Ausfertigung mit Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) in einem ABI PRISM 7500 Sequenzdetektor (PE Biosystems, Foster City, Kanada), einschließlich der extrahierten RNA-Proben sowie Positiv- und Negativkontrollen. Die SYBR-Grün-Fluoreszenz wurde über 40 Amplifikationszyklen gemessen. Für jede quantifizierte Vorlage wurde die mittlere Zykluszahl berechnet, bei der die Produktakkumulation in den linearen Bereich (CT) eintrat. Replizieren CT-Werte waren innerhalb von 0,4 Zyklen voneinander. Der 18SrRNA-CT-Wert für eine gegebene Vorlage wurde von dem CT subtrahiert, das für jede interessierende mRNA (ICP0 und IE1) aus derselben Vorlage erhalten wurde, um den normalisierten CT-Wert (ΔCT) für jede Vorlage zu erhalten.

Tumor-Nekrose-Faktor-α und Interleukin-6-Genexpression.

Zur Quantifizierung von TNF-α- oder IL-6-mRNA wurde 1 µl cDNA zusammen mit den oben gezeigten Primern in einer 20 µl-Reaktion unter Verwendung von SYBR-Grün als Marker für den DNA-Gehalt verwendet. Die verwendeten Primer waren: Beta-Aktin: Vorwärts: 5′-TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3′, Rückwärts: 5′-TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; TNF-a Vorwärts: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT HANDELN GAA CTT CG-3′, Rückwärts: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Vorwärts: 5′-ACA GCC HANDELN CAC CTC TTC AG -3′, Rückwärts: 5′-GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3′. 12 In der Reaktion waren keine Nebenprodukte vorhanden, wie das am Ende der Reaktion bereitgestellte Dissoziationsmuster und die Agarosegelelektrophorese (Daten nicht gezeigt) zeigen. Die Amplifikationseffizienz des TNF-α und der IL-6-Produkte war die gleiche wie die von Beta-Aktin, wie durch die Standardkurven der Amplifikation angegeben, so dass wir die Formel verwenden können: faltenzunahme = 2- (ΔCt A-ΔCtB). Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um eine statistische Auswertung zu ermöglichen.

Ergebnisse

Ein PCR–Reverse-Hybridisierungs-Assay wurde eingesetzt, um die DNA von acht verschiedenen Herpesviren in den Bandscheibenproben von Patienten mit Bandscheibenvorfall zu screenen (Abb. 1). Herpesvirus-DNA wurde in 13 von 16 Proben nachgewiesen (81,25%). HSV-1 zeigte die höchste Prävalenz bei neun Patienten (56,25%), während CMV bei sechs Patienten (37,5%) nachgewiesen wurde (Tabelle I). Zwei Patienten waren sowohl mit HSV-1 als auch mit CMV koinfiziert. DNA aus HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 und HHV8 wurde in den Bandscheibenproben von keinem der Patienten nachgewiesen. Keiner der Kontrollpatienten (C1 und C2) wurde positiv auf das Vorhandensein von Herpesvirus-DNA getestet (Abb. 1).

Der Status der HSV-1- und CMV-Infektion in den Bandscheibenproben wurde untersucht, indem die potenzielle Expression viraler Transkripte durch Echtzeit-qRT-PCR untersucht wurde. Die Genexpression des Herpesvirus wurde in keiner der getesteten Proben nachgewiesen, Dies zeigt das Fehlen einer aktiven Virusinfektion, Dies deutet auf die Etablierung einer latenten Herpesvirusinfektion in diesen Proben hin.

Die Seropositivität der Patienten wurde ebenfalls untersucht. Alle HSV-1- oder CMV-PCR-positiven Patienten wiesen IgG+ -Antikörper für dasselbe Virus auf (Tabelle I). In drei Fällen für HSV-1 und in sechs Fällen für CMV wurden IgG + -Antikörper ohne gleichzeitige Prävalenz viraler DNA nachgewiesen. Darüber hinaus waren die HSV-1- und CMV IgM + -Antikörper aus dem peripheren Blut bei allen Patienten negativ, was darauf hindeutet, dass keiner der Patienten zum Zeitpunkt der chirurgischen Exzision eine akute Herpesvirusinfektion hatte.

Neben dem makroskopischen Hinweis auf eine Entzündung um den Bandscheibenvorfall erhielten wir auch experimentelle Hinweise auf eine Entzündung in den Bandscheibenproben, indem wir die mRNA-Spiegel von TNF-α und IL-6 in allen Proben mittels qRT-PCR untersuchten. Die Analyse zeigte einen etwa zwei- bis dreifachen Anstieg beider Entzündungsmarker in den Proben im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 2). Interessanterweise zeigten die Patienten, die sowohl mit HSV-1 als auch mit CMV koinfiziert waren, die höchsten TNF-α- und IL-6-Spiegel. Darüber hinaus zeigten zwei von drei Patienten (Patienten 2 und 8) ohne Anzeichen einer Virusinfektion niedrigere TNF-α-Spiegel. Diese negative Korrelation wurde für IL-6-Spiegel bei diesen Patienten nicht gefunden.

Diskussion

Die vorliegende Studie legt das Konzept nahe, dass eine Herpesvirusinfektion die Bandscheibendegeneration fördern könnte. Wir konnten HSV-1- und CMV-DNA in einer großen Anzahl menschlicher Bandscheibenproben nachweisen, die während der Diskektomie entnommen wurden.

Frühere Low-Grade-Infektion wurde als mögliche Ursache der Bandscheibendegeneration vorgeschlagen. 2,4 Mehrere Autoren haben den Zusammenhang zwischen modischen Typ-1-Signalen (erhöhte Marksignalintensität in T2-gewichteten MR-Bildern und verringerte Signalintensität in T1-gewichteten MR-Bildern und fibrovaskulärem Gewebe in den Endplatten) und Infektionen hervorgehoben. 13,14 Wenn die Patienten keine starken Rückenschmerzen, keine Temperatur oder ein abnormales Blutprofil haben, ist es schwierig, zwischen Modic 1-Veränderungen und einer niedriggradigen Infektion zu unterscheiden. 13,14

Die Beziehung zwischen Virusinfektion und Apoptose wurde umfassend untersucht, um die Mechanismen der Apoptoseinduktion durch Viren zu klären. 15,16 Es ist nun bekannt, dass Parvovirus B19 und insbesondere sein NS-1-Protein eine starke zytotoxische Wirkung auf die Wirtszellen hat und Apoptose in den infizierten Zellen verursacht. 17 Viren spielen eine Rolle bei der Pathogenese verschiedener Formen von Arthritis. Stahl et al 5 virale DNA aus mehreren Viren im Synovialgewebe von Patienten mit früher Arthritis nachgewiesen. Eine kürzlich durchgeführte Studie legt nahe, dass die fortgeschrittenen Stadien der Arthrose mit einer erhöhten Entzündung und Schädigung des Gelenkknorpels aufgrund des Parvovirus B19 zusammenhängen können. 18 In einer anderen Studie wurde vorgeschlagen, dass das humane Parvovirus B19 an der Initiierung und Aufrechterhaltung der Synovitis bei rheumatoider Arthritis beteiligt ist, was zu Gelenkläsionen im Verlauf einer übermäßigen Synthese von entzündlichen Zytokinen und proteolytischen Enzymen führt. 19

HSV-1-Infektionen sind weltweit endemisch. Über 90% der Erwachsenen haben im fünften Jahrzehnt Antikörper gegen HSV-1. Herpesviren sind bei Kindern allgegenwärtige Krankheitserreger, die nach einer aktiven Infektion latent bleiben. 20,21 Während der Anfangsphase der Infektion erfolgt die Virusreplikation in Ganglien mit Überleben einiger Zellen, die das virale Genom erhalten, das mit der normalen Zellfunktion kompatibel ist. Dieses feine Gleichgewicht zwischen Wirtszellen und dem Virus kann durch verschiedene Reize gestört werden, was zu einer Reaktivierung führt. 22

In unserer Studie hatte keiner der Patienten eine akute Herpesinfektion. Dies war sowohl auf serologischer Ebene aufgrund des Fehlens von IgM + -Antikörpern aus dem peripheren Blut als auch auf molekularer Ebene aufgrund des Fehlens viraler mRNA-Transkripte aus den Disc-Proben offensichtlich. Somit, Die hohe Prävalenz der HSV-1-Infektion im Kindesalter, sowie seine Retention im Nervensystem, könnte eine zufriedenstellende Erklärung für das Vorhandensein von HSV-1 und CMV in der Bandscheibe bieten.

Es stellt sich die Frage, wie die Viren in den Bandscheibenraum gelangen. Es ist bekannt, dass große Gefäßkanäle die Endplatten während des frühen fötalen Lebens kreuzen, die anschließend mit der Geburt abnehmen und im Alter von vier bis sechs Jahren vollständig verschwinden, was die Bandscheibe zu einem der größten avaskulären Gewebetypen im Körper macht. 23 Man könnte spekulieren, dass das Vorhandensein viraler DNA in der Bandscheibe sekundär zur Migration von Makrophagen oder anderen Zellen, die virale DNA enthalten, in die Bandscheibe im Kindesalter ist, während die Bandscheibenumgebung noch reich an Blutgefäßen ist. Andere Mechanismen könnten ebenfalls eine Rolle spielen, da bekannt ist, dass das Herpes-simplex-Virus in neuronalen Axonen durch entzündliche Zytokine aktiviert werden kann, wie IL-1 und TNF-α 24,25 und durch antidromale Migration könnte der Bandscheibenraum betroffen sein.

Somit aktiviert die entzündete oder verletzte Bandscheibe, die eine Vielzahl von entzündungsfördernden Zytokinen produziert, latente Viren. Diese Mechanismen könnten auch das Vorhandensein von DNA aus zwei oder mehr Viren in den Scheibenproben erklären. Selbst wenn das Vorhandensein von Viren ein sekundäres Phänomen ist, kann ihre Anwesenheit zur Pathogenese der Bandscheibendegeneration beitragen, da virale Antigene die Verschlechterung der Bandscheibe durch Aktivierung des Entzündungsmilieus weiter verstärken, wodurch aktivierte Makrophagen und andere Zellen Gewebeschäden verursachen können.

In unserer Studie ergab die intraoperative Beurteilung des Operationsfeldes makroskopische Hinweise auf eine Entzündung um den Bandscheibenvorfall. Der Nachweis der Entzündung in den Bandscheibenproben und der Beitrag der Virusinfektion zur Verstärkung des Entzündungsprozesses stammten aus der Analyse der mRNA-Spiegel bekannter Gene, die mit Entzündungen assoziiert sind, wie TNF-α und IL-6. Beide Entzündungsmarker zeigten in den Proben der Patienten im Vergleich zu den Kontrollen etwa zwei- bis dreimal höhere Spiegel. Interessanterweise wiesen die Proben, die sowohl mit HSV-1 als auch mit CMV koinfiziert waren, die höchsten Spiegel an TNF-α und IL-6 auf, was auf eine synergistische Wirkung der Viren hindeutet. Darüber hinaus waren die TNF-α-Spiegel bei den Patienten, bei denen wir keine virale DNA nachweisen konnten, so niedrig wie in den Kontrollfällen.In einem kürzlich erschienenen Übersichtsartikel heißt es, dass die Bandscheibendegeneration keine Diagnose ist, sondern ein Ausdruck des Zustands der Bandscheibe, der das Ergebnis mehrerer Faktoren ist, die einzeln oder gemeinsam wirken. 1 Anstatt das Ergebnis eines einzigen Prozesses zu sein, kann die Bandscheibendegeneration eine Reihe von möglichen Ursachen haben, darunter mechanische, Alterung, genetische, systemische, toxische und / oder Infektionen. Das Fehlen eines viralen Nachweises bei allen unseren 16 Patienten steht im Einklang mit der multifaktoriellen Ursache des Bandscheibenvorfalls. Es ist bekannt, dass genetische Faktoren abnormale Bestandteile der Matrix 26-28 erzeugen, die die Struktur und Funktion der Bandscheibe beeinträchtigen und die Anfälligkeit des Bandscheibengewebes für mechanische Beanspruchung erhöhen. 29 Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass genetische Faktoren das Risiko einer Degeneration erhöhen, 30-35 Sie berücksichtigen jedoch nicht alle Fälle, 28,36 mit Variationen zwischen verschiedenen ethnischen Bevölkerungsgruppen 37 So dass große multiethnische Bevölkerungsstudien erforderlich sind. 38

Das Vorhandensein der Viren in der Disc kann zu einer Umgebung führen, in der die Disc anfällig für Schäden durch mechanische Beanspruchung und Trauma ist. Es ist wahrscheinlich, dass virale DNA auf Bandscheibenebene vorhanden ist, aber die mechanischen Belastungen, die zur Degeneration beitragen sollen, finden auf lumbosakraler Ebene statt, wo Probleme weitaus häufiger auftreten. 1 Eine geringgradige Infektion mit oder ohne genetischen Einfluss kann die Anfälligkeit der Bandscheibe für Umweltfaktoren erhöhen, die sekundär die biologischen Ereignisse antreiben, die zu einer Bandscheibendegeneration führen. Möglicherweise wirkt Herpes-DNA als Faktor, der die strukturellen Eigenschaften der Matrix in der Bandscheibe durch Modulation der Apoptose und der lokalen Entzündungsreaktion verändert, was darauf hindeutet, dass eine Virusinfektion oder Reaktivierung mit der Krankheit verbunden ist.Die Entdeckung von Marshall und Warren 39, dass eine Infektion durch Helicobacter pylori für die Entwicklung von Magengeschwüren verantwortlich war, führte zu einer großen Verschiebung des medizinischen Verständnisses. Die Möglichkeit, dass ein infektiöser Prozess zur Bandscheibendegeneration beitragen kann, sollte ernsthaft in Betracht gezogen werden.

Wir glauben, dass dies die erste Studie ist, die das Vorhandensein von Herpesviren in der Bandscheibe von Patienten mit Bandscheibenvorfall dokumentiert. Weitere Studien sind notwendig, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu bestimmen und die mögliche Rolle von Herpesviren bei der Pathogenese degenerativer Bandscheibenerkrankungen zu unterstützen.

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