KINETISCHE ANALYSELINIE WEAVER-BURK-GLEICHUNG DOPPELTE REZIPROKE DARSTELLUNG DER ENZYMKINETIK

8.3. Lineweaver-Burk-Gleichung (Doppelter reziproker Plot) :

1934 nahmen Lineweaver und Burk eine einfache mathematische Änderung in der Michalies–Menten-Gleichung vor, indem sie eine doppelte Inverse von Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit zeichneten.

Line–Burk-Plot wird erhalten, indem der Kehrwert beider Seiten der Michalies-Menteris-Gleichung (MME) genommen wird.

Im Line weaver Burk (LB) Plot wird die Michaelis Menten Gleichung in eine geradlinige Kurve umgewandelt.

Es wird verwendet, um die Vmax von der Position des Abschnitts auf der X-Achse zu schätzen.

• Die gerade Linie ist gegeben durch Y = MX + C, wobei C der Y-Schnittpunkt der Regression von Y auf X und M die Steigung ist.
• Wenn der M-Wert zunimmt, nimmt die Steigung zu.
• Wenn wir den Wert von Vmax gleich konstant machen, ist der Km-Wert hoch und wenn der Km-Wert konstant ist, nimmt der Vmax-Wert ab.

Dabei wird die hyperbolische Kurve zu einer Geraden und der Absolutwert des X-Abschnitts der Linie ist die Affinität (1/Km) des Enzyms zum Substrat. Der Y-Achsenabschnitt ist 1/Vmax. Die Steigung der Linie beträgt Km/Vmax. Auch dies geschah ursprünglich subjektiv. Es ist die viel feinere Methode, um die am besten geeigneten Parameter für die nicht transformierte Michaelis-Menten-Beziehung zu finden.

Anwendung

Die Lineweaver-Burk-Diagramm verwenden, um die Km und Vmax zu bestimmen,. Der Y-Schnittpunkt eines solchen Graphen entspricht der Umkehrung von Vmax; der X-Schnittpunkt des Graphen repräsentiert -1 / Km. Es gibt einen schnellen, visuellen Eindruck von den verschiedenen Formen der Enzymhemmung.

8.4. Eadie–Hofstee–Diagramm

Das Eadie-Hofstee-Diagramm ist eine grafische Darstellung der Enzymkinetik, in der die Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion des Verhältnisses zwischen Geschwindigkeit und Substratkonzentration aufgetragen ist:

In dieser Michaelis-Menten-Gleichung wird dargestellt als

Invertieren und multiplizieren mit Vmax :

Anwendung des Eadie-Hofstee-Plots

Schnelle Identifizierung von Km und Vmax

8.5. Hanes Woolf Plot

Grafische Darstellung des Verhältnisses der anfänglichen Substratkonzentration zur Reaktionsgeschwindigkeit V ist gegen die Substratkonzentration aufgetragen.

Michaelis-Menten-Gleichung wird abgeleitet als

Invertieren und multiplizieren :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Enzymhemmung

Enzyme sind Proteine, die als Katalysator für die Reaktionen wirken. Aber dort wird die Aktivität durch die Moleküle gehemmt oder blockiert, die chemische Substanzen (organisch / anorganisch) in der Natur sind. Diese Moleküle oder Verbindungen werden als Inhibitoren bezeichnet, und der Prozess, durch den sie das Enzym inaktivieren oder seine Aktivität blockieren, wird als Enzymhemmung bezeichnet.

Sie hemmen die katalytische Aktivität des Enzyms reversibel oder irreversibel, indem sie die für die enzymatische Aktivität erforderlichen Aminosäureseitenketten modifizieren.

In der Arzneimittelforschung werden Arzneimittelanaloga zur Entgiftung vieler Antitoxine verwendet, da sie hemmend wirken.

8.6.1. Regeln, gefolgt von Enzym-Inhibitionsreaktionen

1. Enzym bindet mit Substrat im Verhältnis 1 : 1 an der aktiven Stelle in einer Lock-Key-Anordnung oder induzierten Passform.
2. Inhibitorverbindungen konkurrieren mit dem Substrat um die allosterische katalytische Stelle auf First-come-First-Basis, um einen Enzyminhibitorsubstratkomplex oder Enzyminhibitorkomplexe herzustellen.
3. Enzym und Substrat oder Inhibitoren reagieren kinetisch miteinander, was als kinetische Konstanten einer katalytischen Reaktion ausgedrückt wird.
4. Physiologische Bedingungen wie pH-Wert, Temperatur, Konzentration von Substrat oder Reaktanten bestimmen die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen.
5. Intermolekulare Formen zwischen Enzymuntereinheiten, Substrat oder Inhibitor aktive Gruppeninteraktionen, physikalische Eigenschaften der Bindungsnatur : elektrophile, hydrophile, nucleophile und metalloprotien Natur; wasserstoffbrücken beeinflussen die Gesamtenzymreaktionsraten und die Art der Hemmung.

8.6.2. Arten der inreversiblen Enzymhemmung

8.6.2.1. Kompetitive Hemmung (reversibel) : Hierbei besteht eine Konkurrenz zwischen Inhibitor und Substrat für das aktive Zentrum.

Die katalytische Stelle des Enzyms wird vom Inhibitor besetzt und seine Aktivität gehemmt. Die Hemmung ist jedoch reversibel. In diesem Fall werden sowohl Enzymsubstrat als auch Enzyminhibitorkomplex gebildet.

Auswirkung auf die Affinität : – Wenn die Inhibitorkonzentration ansteigt, nimmt ihre Affinität zu, aber die Affinität des Substrats nimmt ab und der Km-Wert nimmt zu. Wenn jedoch die Substratkonzentration zunimmt, nimmt ihre Affinität zu und die Affinität des Inhibitors nimmt ab und der Km-Wert nimmt ab, d.h.,

Der Inhibitor bindet an aktive Stellen eines Enzyms, was bedeutet, dass der Inhibitor mit dem Substrat um die Bindung an der aktiven Stelle konkurriert, daher nimmt die Affinität des Substrats zum Enzym ab, daher steigt der Km-Wert. Der neue km ist gegeben durch Km, wobei

wobei

I = konzentration des Inhibitors

Kdi = Dissoziationskonstante des Inhibitors.

Wenn die Inhibitorkonzentration ansteigt, steigt der km-Wert, wenn die Affinität des Substrats abnimmt. Wenn die Dissoziationskonstante von größer ist, ist der Enzyminhibitorkomplex größer, a ist kleiner, daher ist km kleiner. Der Wert von a ist gleich 1 oder größer als 1. Neuer Wert von Km ist aKm

Effekt auf Vmax

Vmax wird bei unendlicher Substratkonzentration berechnet.

Vmax = Kcat

Bei unendlicher Substratkonzentration liegen alle Enzyme in Form des Enzymsubstratkomplexes i vor.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) Methotrexat :

Es ist ein kompetitiver Inhibitor der Dihydrofolatreduktase (DHFR). Dieses Medikament wird zur Krebstherapie eingesetzt. Es ist strukturell Folsäure ähnlich und hemmt somit die Folatreduktase kompetitiv. Es verhindert die Bildung von Tetrahydrofolat. Daher wird die DNA-Synthese gestört.

(c) MAO-Hemmer (Monoaminoxidase) :

Sie sind, erste Klasse von Antidepressiva entwickelt werden. MAO-Hemmer erhöhen das Niveau von Serotonin Dopamin durch Hemmung der MAO. z. Katecholamine (Epinephrin und Norepinephrine).

(d) Dicumarol :

Dieses Medikament ähnelt Vitamin K. Medikament Warfarin wirkt als Antikoagulans durch kompetitive Hemmung von Vitamin K.

8.6.3. Nicht kompetitive Hemmung

Es gibt keine Konkurrenz zwischen Inhibitor und Substrat, da die Anhaftungsstellen von Substrat und Inhibitor unterschiedlich sind. Inhibitor hat keine strukturelle Ähnlichkeit mit Substrat kann daher nicht an freies Enzym binden. Inhibitoren bindet mit Enzymsubstrat-Komplex, der Inhibitor Bindungsstelle aussetzen. Die Bindung des Inhibitors kann eine Verzerrung des aktiven Zentrums oder der allosterischen Stelle verursachen, die die Katalyse inaktiviert.

Wirkung auf die Affinität:

Hohe Affinität des Inhibitors bedeutet geringe Dissoziation des Enzymsubstratkomplexes zum Enzymsubstrat. In diesem bindet Inhibitor an andere dann aktive Stelle auf Enzymsubstratkomplex. Das bedeutet, dass Inhibitoren eher eine Affinität zum ES-Komplex als zum Enzym zeigen. So in Gegenwart von Inhibitor die Affinität des Enzyms gegenüber Substrat erhöht. Dies verringert die Km. Daher

Wirkung auf Vmax

Vmax wird bei unendlicher Substratkonzentration berechnet. Bei unendlicher Substratkonzentration liegen alle Enzyme in Form eines Substratkomplexes vor. Der Inhibitor zeigt Affinität zum Enzymsubstratkomplex. Somit bindet der Inhibitor an den Enzymsubstratkomplex und verhindert die Katalyse des Enzymsubstratkomplexes zu Enzym und Produkt. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Gemischte (nicht kompetitive) Hemmung

Dieser Inhibitor ist dem Substrat strukturell nicht ähnlich, kann aber sowohl an freies Enzym als auch an den Enzymsubstanzkomplex binden.

Wenn Inhibitor bindet an das Enzym weg von den aktiven Stellen. Es induziert die Konformationsänderungen und reduziert seine katalytische Aktivität. Somit werden Enzyminhibitor- und Enzymsubstratinhibitorkomplexe nicht produktiv. Die Substratkonzentration kehrt die Reaktion nicht um. Daher führt die Hemmung zu unverändertem Km, aber reduziertem Vmax.

Lineweaver Burk Plot wird zur Bestimmung von Km und Vmax in der Enzymkinetik verwendet. Der Y-Schnittpunkt eines solchen Graphen entspricht der Umkehrung von Vmax, der X-Schnittpunkt des Graphen repräsentiert kompetitive Inhibitoren, daher die gleichen Y-Abschnitte (da Vmax von kompetitiven Inhibitoren nicht beeinflusst wird), aber es gibt verschiedene Slops.

Ein nicht kompetitiver Inhibitor erzeugt ein Diagramm mit demselben X-Abschnitt wie Km, ist jedoch nicht betroffen, aber unterschiedliche Steigungen mit Y-Abschnitten.

8.7. Kinetik der Multisubstratreaktion

In der Enzymkinetik beinhalten einfache Reaktionen, dass ein Substrat an ein Enzym bindet und katalytische Reaktionen durchläuft. Diese Bedingung ist nicht üblich. Die meisten biochemischen Reaktionen werden durch zwei oder mehr an den Reaktionen beteiligte Substrate katalysiert. Zum Beispiel katalysierte ein Enzym E die Reaktion mit zwei Substraten A und B und lieferte das Produkt P und Q.

Diese Art der Reaktion wird als Bi-Substrat-Reaktion bezeichnet . Diese Reaktion kann auf zwei Arten ablaufen:

8.7.1. Sequentielle

Sowohl die Substrate A und B, binden an das Enzym E, und dann Reaktionen geht Produkte P und Q zu ergeben

Diese Art von Reaktion wird als sequenzielle oder einfache Verdrängungsreaktionen bezeichnet, die weiter in folgende Gruppen unterteilt sind.

Geordnete Substratbindung oder geordneter sequentieller Mechanismus – Bei diesem Typ muss ein Substrat vor einem zweiten Substrat binden.

Diese Reaktion zeigt die sequentielle Bindung von Substraten sowie die sequentielle Freisetzung von Produkt an. Diese Art von Mechanismus wird in den Reaktionen beobachtet, die durch Lactatdehydrogene mit NAD + und Lactat katalysiert werden.

8.7.2. Zufällige Substratbindung – Bei diesem Typ können entweder A oder B zuerst an das Enzym binden, gefolgt vom anderen Substrat und der Freisetzung des Produkts.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Ping-Pong-Mechanismus

Die andere Möglichkeit bei der Bisubstratreaktion besteht darin, dass ein Substrat, A, an das Enzym bindet und bei der Reaktion mit ihm ein Produkt, P, freigesetzt wird und das Enzym in eine modifizierte Form, E‘, übergeht. Das zweite Substrat B kommt herein und bindet mit modifiziertem Enzym, um das zweite Produkt Q zu erhalten und das Enzym E zu regenerieren.

Die Reaktionen, die dem obigen Mechanismus folgen, werden Ping-Pong- oder Doppelverdrängungsreaktionen genannt. Diese Art von Mechanismus wird bei Reaktionen beobachtet, die durch Aminotransferasen katalysiert werden.

Diese Enzyme katalysieren den Transfer einer Aminogruppe von einer Aminosäure zu einer α-Ketosäure.Die gebildeten Produkte sind eine neue Aminosäure, die der Ketosäure entspricht, und eine neue Ketosäure, die dem Kohlenstoffgerüst der Aminosäure entspricht, wie: –

Ein weiteres Beispiel für eine Ping-Pong-Reaktion ist die Phosphoglyceratmutase. Das Enzym erhält Phosphat von einem Substrat und nach Phosphorylierung des Enzyms wird das Phosphat auf das zweite Substrat übertragen.

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