kinetisk analys linje WEAVER-BURK ekvation dubbel ömsesidig PLOT av enzymkinetik

8.3. Lineweaver-Burk ekvation (Dubbel ömsesidig plot):

1934 gjorde Lineweaver och Burk en enkel matematisk förändring i Michalies –Mentens ekvation genom att plotta en dubbel invers substratkoncentration och reaktionshastighet.

linje weaver Burk plot erhålls genom att ta det ömsesidiga på båda sidor av michalies–Menteris ekvationen (MME).

I linje weaver Burk (LB) plot Michaelis Menten ekvationen omvandlas till rak linjekurva.

det används för att uppskatta Vmax från avlyssningspositionen på X-axeln.

• rak linje ges av Y = MX + C, där C är y avlyssning av regressionen av Y på X och M är lutning.
• om m-värdet ökar ökar lutningen.
• om vi gör värdet på Vmax lika med konstant är Km-värdet högt och om Km-värdet är konstant minskar Vmax-värdet.

I detta blir den hyperboliska kurvan en rak linje och absolutvärdet för X-avlyssningen av linjen är affiniteten (1/Km) för enzymet för substratet. Y-avlyssningen är 1 / Vmax. Linjens lutning är Km / Vmax. Återigen gjordes detta ursprungligen subjektivt. Det är den mycket finare metoden för att hitta de bästa passningsparametrarna för det oförändrade Michaelis-Menten-förhållandet.

ansökan

den Lineweaver–Burk tomt använda för att bestämma Km och Vmax,. Y-avlyssningen av en sådan graf motsvarar den inversa av Vmax; grafens X-avlyssning representerar -1/Km. Det ger ett snabbt, visuellt intryck av de olika formerna av enzymhämning.

8.4. Eadie–Hofstee Plot

Eadie–Hofstee diagram är en grafisk representation av enzymkinetik där reaktionshastigheten ritas som en funktion av förhållandet mellan hastighet och substratkoncentration:

I denna Michaelis Menten ekvation representeras som

invertera och multiplicera med Vmax :

tillämpning av Eadie-Hofstee Plot

snabb identifiering av Km och Vmax

8.5. Hanes Woolf Plot

grafisk representation av förhållandet mellan den initiala substratkoncentrationen och reaktionshastigheten V ritas mot substratkoncentrationen .

Michaelis-Menten ekvation härleds som

invertera och multiplicera med :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Enzymhämning

enzymer är proteiner som verkar som en katalysator för reaktionerna. Men där hämmas eller blockeras aktiviteten av molekylerna som är kemiska ämnen (organiska / oorganiska) i naturen. Dessa molekyler eller föreningar kallas hämmare och processen genom vilken de inaktiverar enzymet eller blockerar dess aktivitet kallas enzymhämning.

de hämmar enzymkatalytisk aktivitet reversibelt eller irreversibelt genom att modifiera de aminosyrasidokedjor som krävs för enzymatisk aktivitet.

I läkemedelsupptäckt är läkemedelsanaloger design för avgiftning av många antitoxiner eftersom de har hämmande verkan.

8.6.1. Regler följt av enzymhämningsreaktioner

1. enzym binder med substrat i 1 : 1-förhållande på aktivt ställe i ett låsnyckelarrangemang eller inducerad passform.
2. Inhibitorföreningar konkurrerar med substrat för allosterisk katalytisk plats på först till kvarn för att göra enzymhämmare substratkomplex eller enzymhämmare komplex.
3. enzym och substrat eller hämmare reagerar med varandra på ett kinetiskt sätt som uttrycks som kinetiska konstanter för en katalytisk reaktion.
4. fysiologiska tillstånd som pH, temperatur, koncentration av substrat eller reaktanter bestämmer hastigheten för enzymatiska reaktioner.
5. intermolekylära former mellan enzymunderenheter, substrat eller hämmare Aktiva gruppinteraktioner, fysikaliska egenskaper av bindande natur: elektrofil, hydrofil, nukleofil och metalloprotien natur; vätebindning påverkar de totala enzymreaktionshastigheterna och inhiberingsmetoden.

8.6.2. Typer av Inreversibel enzymhämning

8.6.2.1. Konkurrenshämning (reversibel) : i detta finns konkurrens mellan hämmare och substratet för det aktiva stället.

katalytisk plats för enzym upptas av hämmare och dess aktivitet hämmas. Men hämningen är reversibel. I detta fall bildas både enzymsubstrat och enzymhämmarkomplex.

effekt på affinitet :- när inhibitorkoncentrationen ökar ökar dess affinitet men substratets affinitet minskar och Km-värdet ökar. Men när substratkoncentrationen ökar minskar dess affinitetsökning och affiniteten hos inhibitorn Och Km-värdet minskar, dvs.,

hämmaren binder till aktiva ställen i ett enzymer som innebär att hämmaren konkurrerar med substrat för bindning vid aktivt ställe, varför substratets affinitet mot enzym minskar därmed km-värdet ökar. Den nya km ges av Km, där

där

I = koncentration av hämmare

KDI = dissociationskonstant för hämmare.

när inhibitorkoncentrationen ökar ökar km-värdet när substratets affinitet minskar. Om dissociationskonstanten av är mer, enzymhämmare komplex Mer, a är mindre sålunda km är mindre. Värdet på a är lika med 1 eller större än 1. Nytt värde på Km är aKm

effekt på Vmax

Vmax beräknas vid oändlig substratkoncentration.

Vmax = Kcat

vid oändlig substratkoncentration är alla enzymer i form av enzymsubstratkomplex i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) metotrexat :

det är en konkurrerande hämmare av dihydrofolatreduktas (DHFR). Detta läkemedel används för cancerterapi. Det är strukturellt liknar folsyra således hämmar folatreduktas konkurrenskraftigt. Det förhindrar bildning av tetra hydrofolat. Därför lider DNA-syntes.

(c) MAO-hämmare (Mono Aminoxidas) :

de är första klass av antidepressiva medel som ska utvecklas. MAO-hämmare ökar nivån av serotonin dopamin genom att hämma MAO. T. ex. Katekolaminer (epinephrin och norepinephrines).

(d) Dicumarol :

detta läkemedel liknar vitamin K. Drug warfarin fungerar som ett antikoagulant genom att konkurrenskraftigt hämma vitamin K.

8.6.3. Okompetitiv hämning

det finns ingen konkurrens mellan hämmare och substratet eftersom ställen för bindningar av substratet och Hämmaren är olika. Hämmare har ingen strukturell likhet med substrat därför kan inte binda till fritt enzym. Hämmare binder med enzymsubstratkomplex som exponerar inhibitorbindningsstället. Bindning av hämmare kan orsaka snedvridning av det aktiva stället eller allosteriska stället som inaktiverar katalys.

effekt på affinitet :

hög affinitet av hämmare betyder låg dissociation av enzymsubstratkomplex till enzymer substrat. I detta binder hämmare till andra då aktiva ställen på enzymsubstratkomplex. Det betyder att hämmare visar affinitet för ES-komplex snarare än enzym. Således i närvaro av hämmare ökar affiniteten hos enzymet mot substrat. Detta minskar Km. Därför

effekt på Vmax

Vmax beräknas vid oändlig substratkoncentration. Vid oändlig substratkoncentration är alla enzymer i form av enzymer substratkomplex. Hämmaren visar affinitet för enzymer substratkomplex. Således binder hämmare till enzymer substratkomplex och förhindrar katalys av enzymsubstratkomplex till enzym och produkt. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Blandad (icke-konkurrenskraftig) hämning

denna hämmare liknar inte substrat strukturellt men kan bindas till fritt enzym och enzymet substatkomplex båda.

när hämmare binder till enzymet bort från de aktiva ställena. Det inducerar konformationsförändringar och minskar dess katalytiska aktivitet. Således blir enzymhämmare och enzymsubstratinhibitorkomplex icke produktiva. Substratkoncentrationen vänder inte reaktionen. Därför leder hämning till oförändrad Km men minskad Vmax.

Lineweaver Burk plot används för att bestämma Km och Vmax i enzymkinetik. Y-avlyssningen av en sådan graf motsvarar inversen av Vmax, X-avlyssningen av grafen representerar konkurrerande hämmare, därav samma Y-avlyssningar (som Vmax påverkas inte av konkurrerande hämmare) men det finns olika slops.

icke-konkurrerande hämmare producerar tomt med samma X-avlyssning som Km är opåverkad men olika backar med Y-avlyssningar.

8.7. Kinetik av Multisubstratreaktion

I enzymkinetiken involverar enkla reaktioner ett substratbindning till ett enzym och genomgår katalytiska reaktioner. Detta tillstånd är inte vanligt. En majoritet av biokemiska reaktioner katalyseras av två eller flera substrat som deltar i reaktionerna. Till exempel katalyserade ett enzym e reaktionen som involverade två substrat A och B och ger produkten P och Q.

denna typ av reaktion kallas Bi-Substratreaktion . Dessa reaktioner kan fortsätta på två sätt:

8.7.1. Sekventiell

både substraten A och B binder till enzymet E, och sedan fortsätter reaktionerna för att ge produkterna P och Q

denna typ av reaktion kallas sekventiella eller enkla förskjutningsreaktioner som vidare delas in i följande grupper.

beställd substratbindning eller ordnad Sekventiell mekanism – i denna typ måste ett substrat binda före ett andra substrat.

denna reaktion indikerar Sekventiell bindning av substrat såväl som Sekventiell frisättning av produkten. Denna typ av mekanism observeras i reaktionerna katalyserade av laktatdehydrogener som involverar NAD+ och laktat.

8.7.2. Slumpmässig substratbindning-i denna typ kan antingen A eller B binda till enzymet först, följt av det andra substratet och frisättningen av produkten.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Pingismekanism

den andra möjligheten i bi-substratreaktion är att ett substrat, a, binder till enzymet och vid reaktion med det frigörs en produkt, P, och enzym förvandlas till en modifierad form, E’. Det andra substratet, B, kommer in och binder med modifierat enzym för att ge andra produkten, Q och regenerera enzymet, E.

reaktionerna efter ovanstående mekanism kallas Ping-Pong eller dubbelförskjutningsreaktioner. Denna typ av mekanism observeras i reaktioner katalyserade av aminotransferaser.

dessa enzymer katalyserar överföringen av en aminogrupp från en aminosyra till en Xiaomi-keto-syra.De bildade produkterna är en ny aminosyra som motsvarar ketosyra och en ny ketosyra som motsvarar kolskelett av aminosyra såsom:-

ett annat exempel på ping pong-reaktion är fosfoglyceratmutas. Enzymet får fosfat från ett substrat och efter fosforylering av enzym överförs fosfatet till det andra substratet.

Nästföregående