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Viren erleben ganz unterschiedliche Umgebungen, je nachdem, ob sie sich in einer Wirtszelle oder auf dem Weg von einem Wirt zum anderen replizieren. Innerhalb einer Zelle sind das Virus und die Viruskomponenten einer reduzierenden Umgebung ausgesetzt, in der das Redoxpotential hauptsächlich durch Glutathion bestimmt wird (18). Im Gegensatz dazu ist das Virus außerhalb einer Zelle Sauerstoff und toxischen Produkten ausgesetzt, die aus Sauerstoff stammen, wie Wasserstoffperoxid, Superoxid und Hydroxylradikalen, reaktiven Spezies, die das Potenzial haben, das Virus zu inaktivieren. Um mit solchen hochreaktiven Verbindungen fertig zu werden, exprimieren Pflanzen und Tiere Enzyme, die sie in ungiftige Produkte umwandeln können. Beispiele für solche Enzyme sind Katalase, Peroxidasen und Superoxiddismutase (28). Hier beschreiben wir die Ergebnisse von Studien, die das Vorhandensein von Katalase im gereinigten Herpes-simplex-Virion belegen. Anschließend wurde getestet, ob die interne Katalase das Virus vor der Inaktivierung durch H2O2 schützen kann.

Katalase-Studien wurden mit Herpes-simplex-Virus 1 (HSV-1) durchgeführt, das auf Vero-Zellen in Kultur gezüchtet und durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wurde. Wenn Virussuspensionen auf 1% H2O2 eingestellt wurden, begannen sich sofort Sauerstoffblasen zu bilden, was auf das Vorhandensein von Katalase hinweist (Abb. 1a, linkes Rohr). Blasen wurden nach einigen Sekunden Inkubation bei Raumtemperatur visuell sichtbar und bildeten sich weiter und vergrößerten sich für mindestens 20 min. Es bildeten sich jedoch keine Blasen, wenn der Katalaseinhibitor Natriumazid der Virussuspension vor der H2O2-Behandlung zugesetzt wurde (Fig. 1a, rechts). Assays waren auch negativ, wenn (i) das Virus vor der Zugabe von H2O2 durch Zentrifugation aus der Lösung entfernt wurde oder (ii) HSV-1-Kapside (B-Kapside) durch intaktes Virus ersetzt wurden. In ähnlichen Assays wurden Blasen, die auf das Vorhandensein von Katalase hinweisen, nicht mit gereinigtem vesikulärem Stomatitis-Virus oder humanem Adenovirus 2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die Western-Blot-Analyse bestätigte das Vorhandensein von Katalase, die mit dem HSV-1-Virus assoziiert ist, jedoch nicht mit Adenovirus, vesikulärem Stomatitis-Virus (VSV) oder HSV-1-A-Kapsiden (Abb. 1b).

Identifizierung der HSV-1-assoziierten Katalase durch Enzymtest (a), Western Blot-Analyse (b) und Zentrifugation des Saccharose-Dichtegradienten (c). Tafel a zeigt ein Röhrchen mit gereinigtem HSV-1 20 min nach Einstellung der Lösung auf 1% H2O2 (linkes Röhrchen) und eine ähnliche Inkubation, der vor H2O2 ein Katalaseinhibitor (2 mM Natriumazid) zugesetzt wurde (rechts). Beachten Sie die Bildung von Blasen in der linken Röhre, was auf das Vorhandensein von Katalase im Virus hinweist. Die Viruskonzentration betrug 0,25 mg/ml in TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) und die Inkubation erfolgte bei Raumtemperatur. Das Virus war der KOS-Stamm von HSV-1, der auf Monoschichtkulturen von Vero-Zellen gezüchtet und durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt wurde, und der Titer wurde durch Endpunktverdünnung wie zuvor beschrieben bestimmt (14). Panel b zeigt die Ergebnisse eines Western-Blot-Tests auf das Vorhandensein von Katalase in HSV-1, humanem Adenovirus 2 (HAd2), vesikulärem Stomatitis-Virus (VSV) und HSV-1 A-Kapsiden. Humanes Adenovirus 2 und vesikuläres Stomatitis-Virus (Indiana; San Juan Stamm) wurden auf Monoschichtkulturen von HeLa- bzw. Vero-Zellen gezüchtet und nach zuvor beschriebenen Verfahren gereinigt (12, 17). Veröffentlichte Methoden wurden auch zur Reinigung von HSV-1 A- und B-Kapsiden verwendet (23). Hauptkapsidproteine wurden durch Anfärben des Blots mit 1% Ponceau S (obere Reihe) nachgewiesen, während Katalase durch Immunfärbung mit Katalase-spezifischem Antikörper nachgewiesen wurde (Calbiochem; rabbit polyclonal 219010; 1:5000 Verdünnung) (15). Beachten Sie, dass Katalase im HSV-1-Virus nachgewiesen wurde, jedoch nicht in HAd2-, VSV- oder HSV-1-A-Kapsiden. Tafel c zeigt die Ergebnisse der Saccharose-Dichtegradientenanalyse. Insgesamt wurden 50 µg gereinigtes HSV-1 in 50 µl TNE auf einem 600 µl Gradienten von 20% bis 50% Saccharose in TNE zentrifugiert. Zentrifugiert wurde 45 min bei 22.000 upm in einem Beckman SW55 Rotor bei 4°C. Der Gradient wurde fraktioniert und einzelne Fraktionen mittels SDS-PAGE analysiert, gefolgt von Blotting auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) und Anfärbung mit 1% Ponceau S. Der Blot wurde dann abgefärbt und mit Katalase-spezifischem Antikörper (der koinzident mit Standardkatalase migrierte; Worthington LS001872) angefärbt. Beachten Sie, dass die Position des Virus im Gradienten (obere Reihe) mit der der Katalase (untere Reihe) übereinstimmt, was darauf hindeutet, dass die beiden assoziiert sind.

Kontrollexperimente wurden durchgeführt, um zu bestätigen, dass Katalase mit HSV-1 assoziiert war und nicht mit Verunreinigungen, die in der Viruspräparation vorhanden waren. Gereinigtes HSV-1 wurde in eine Bande auf einem Saccharose-Dichtegradienten zentrifugiert, der Gradient fraktioniert und mittels Western-Blot-Analyse einzelne Gradientenfraktionen auf das Vorhandensein von Katalase getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass Katalase in virushaltigen Fraktionen vorhanden war, nicht jedoch in flankierenden (Abb. 1c). Die Ergebnisse werden dahingehend interpretiert, dass Katalase mit HSV-1 assoziiert ist und nicht mit Kontaminanten wie Katalase-haltigen Bakterien oder Wirtszellenmaterialien in der Viruspräparation. Da das HSV-1-Genom nicht für Katalase kodiert (22), muss das Virus-assoziierte Enzym aus der Wirtszelle stammen. Frühe Studien des Vaccinia-Virus zeigten das Vorhandensein von Katalase im reifen Virion (8). Abgesehen von dieser Beobachtung kennen wir keinen anderen Bericht über Katalase als Bestandteil einer Virusstruktur.

Eine weitere Analyse der HSV-1-assoziierten Katalase zielte darauf ab, die Position des Enzyms im Virion zu bestimmen. Es wurden zwei Arten von Experimenten durchgeführt. Zuerst wurde das gereinigte Virus mit dem proteolytischen Enzym Pronase behandelt, um die Virusglykoproteine und alle Proteine, die nicht in der Virionmembran enthalten sind, abzubauen. Es wurde erwartet, dass interne virale Proteine nicht betroffen sind, da Pronase die Lipiddoppelschicht des Virus nicht kreuzt (16). Nach der Katalase-Behandlung wurde das Virus durch Zentrifugation geerntet und das Ausmaß des Katalase-Verlustes durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Die Ergebnisse zeigten keine Hinweise auf Katalase-Verlust in zwei Konzentrationen des getesteten Virus (siehe die Katalase-Bande in Abb. 2a, Fahrspuren 1 und 2). Interne Kontrollen zeigten, dass die Virusoberflächenglykoproteine gB und gH erwartungsgemäß gespalten wurden (Abb. 2a; vergleiche Fahrspuren 2 und 3). In ähnlicher Weise zeigte die Western-Blot-Analyse, dass HSV-1-Glykoprotein D durch Pronase oder Trypsin unter Bedingungen verdaut wurde, bei denen Katalase nicht betroffen war (Abb. 2b). Gereinigte Katalase in Lösung wurde ebenfalls unter den gleichen Bedingungen verdaut. Im Gegensatz dazu kein Abbau von internem Tegument (UL47, UL48 und UL49) oder Kapsidproteinen (UL19, UL38, UL18; Abb. 2a, Spuren 1 und 2) beobachtet. Die Ergebnisse werden interpretiert, um anzuzeigen, dass sich Katalase innerhalb der HSV-1-Hülle befindet.

Lokalisierung von Katalase in HSV-1 durch Behandlung von gereinigten Virionen mit Pronase (Spuren 1 bis 3) und Triton X-100 (a, Spuren 4 und 5) und durch Pronase- und Trypsinbehandlung (b, Spuren 1 bis 3). Panel a zeigt eine SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse von Proteinen, die in intaktem HSV-1 (Spuren 3 und 4) und in Virionen nach Behandlung mit Pronase (Spuren 1 und 2) und Triton X-100 (Spur 5) vorhanden sind. Beachten Sie, dass Katalase in intakten Virionen (Spuren 3 und 4) und in mit Pronase behandelten Virionen (Spuren 1 und 2) vorhanden war, jedoch nicht in Virionen nach Behandlung mit 1% Triton X-100 (Spur 5). Die Pronase-Behandlung erfolgte durch Verdauung von gereinigtem HSV-1 (0,25 mg/ml) mit 1 mg/ml Pronase (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) für 4 h bei 37°C. Nach der Pronase-Behandlung wurde das Virus vor der SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation reisoliert. Die Triton X-100-Behandlung wurde durchgeführt, indem das gereinigte Virus auf 1% Triton X-100 in TNE-Puffer mit 10 mM Dithiothreitol (DTT) eingestellt und 15 min auf Eis (4 ° C) inkubiert wurde. Die resultierenden Kapside wurden dann durch Saccharose-Gradientenzentrifugation vor der SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse gereinigt. (b) Western-Blot-Analyse von gereinigtem HSV-1 nach Behandlung in vitro mit Pronase oder Trypsin. Insgesamt wurden 100 µl gereinigtes HSV-1 (1 mg/ml) auf 2 mg/ml Pronase oder 2 mg/ml Trypsin eingestellt. Eine Kontrollinkubation hatte kein Enzym. Die Mischungen wurden für 2 h bei 37°C inkubiert und die Virionen durch Zentrifugation an einem 20% bis 50%igen Saccharose-Gradienten von Enzymen gereinigt, wie in der Legende zu Fig. 1. Virusproben wurden durch Zentrifugation pelletiert und durch SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse untersucht. Blots wurden für Katalase gefärbt (Kaninchen polyklonal; siehe oben) und Glykoprotein D (Maus-monoklonaler Antikörper DL11; ein Geschenk von Gary Cohen und Roselyn Eisenberg; 1:5.000). Beachten Sie, dass die Proteasebehandlung die Verdauung von Glykoprotein D, aber nicht von Katalase verursachte, was darauf hinweist, dass sich Katalase innerhalb der HSV-1-Membran befindet.

Eine genauere Definition für den Ort der Katalase wurde durch Behandlung von gereinigtem Virus mit dem nichtionischen Detergens Triton X-100 (TX-100) erhalten. Wenn diese Behandlung mit frischem Virus durchgeführt wird, führt dies zum Verlust der Virusmembran, der Membranglykoproteine und fast aller 20 oder mehr Tegumentproteine (alle außer UL36, UL37 und US3) (13, 21, 27). Das Kapsid behält jedoch seine Integrität und keines der wichtigsten Kapsidproteine geht verloren. Die Virus-DNA wird im Kapsid zurückgehalten. Die Experimente umfassten die Behandlung von HSV-1 mit 1% TX-100 und die Isolierung der resultierenden Kapside durch Zentrifugation des Saccharosedichtegradienten. Die Western-Blot-Analyse wurde dann verwendet, um die Kapside auf das Vorhandensein von Katalase zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Virusglykoproteine und Tegumentproteine wie erwartet entfernt wurden und dass auch Katalase entfernt wurde (siehe Abb. 2a, Fahrspuren 4 und 5). Dieses Experiment wird interpretiert, um anzuzeigen, dass Katalase im HSV-1-Tegument vorhanden ist.

Informationen, wie sie in Fig. 2 kann verwendet werden, um die Anzahl der Katalase-Moleküle pro HSV-1-Virion zu bestimmen (15). Diese Messung wurde ausgehend von zwei identischen Aliquots gereinigten Virus durchgeführt. Die beiden wurden zur Bestimmung von (i) der Anzahl der Hauptkapsidproteinmoleküle (UL19) aus einem Coomassie-blau gefärbten Gel und (ii) der Anzahl der 60-kDa-Katalase-Moleküle aus einem kalibrierten Western Blot verwendet. In einer repräsentativen Bestimmung ergab diese Analyse einen Wert von 1:207,5 für das molare Verhältnis von Katalase zu UL19. Da es 955 UL19-Moleküle pro HSV-1-Kapsid gibt, wurde die Anzahl der Katalase-Moleküle pro Kapsid zu 955/207,5 oder 4, 6 bestimmt. Eine zweite ähnliche Bestimmung ergab einen Wert von 7,1 Katalase-Molekülen. Da es in einem aktiven Katalase-Molekül vier 60-kDa-Untereinheiten gibt (11, 20), weisen die Ergebnisse auf das Vorhandensein von 1 bis 2 Katalase-Tetrameren pro Virion hin.

Das Vorhandensein von Katalase im HSV-1-Virion deutet auf die Möglichkeit hin, dass es am Schutz des Virus vor oxidativen Schäden durch H2O2 beteiligt sein könnte. Alternativ kann Katalase passiv in HSV-1 eingebaut werden, da das Tegument im Zytoplasma der Wirtszelle hinzugefügt wird und keine Schutzfunktion hat. Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, untersuchten wir die Empfindlichkeit von gereinigtem HSV-1 gegenüber Inaktivierung durch H2O2in vitro. HSV-1 wurde mit H2O2 in Gegenwart oder Abwesenheit des Katalase-Inhibitors Natriumazid (NaN3) behandelt und danach der Virustiter bestimmt (in Abwesenheit von Katalase-Inhibitor). Die Ergebnisse zeigten, dass, während 50 mM H2O2 eine bescheidene Abnahme des Titers (3- bis 4-fach) verursachte, eine letale Wirkung von 106-fach oder größer beobachtet wurde, wenn NaN3 vorhanden war (Tabelle 1). Kontrollexperimente zeigten eine geringe Abtötung von HSV-1 durch NaN3 allein (Tabelle 1). Die Ergebnisse werden dahingehend interpretiert, dass Katalase einen signifikanten Schutz gegen die Inaktivierung von HSV-1 durch H2O2 bietet.

Es ist nicht zu erwarten, dass HSV-1 vor oxidativen Schäden durch H2O2 geschützt werden muss, während es mit einer Wirtszelle assoziiert ist. Wie oben beschrieben, befindet sich in der Zelle eine reduzierende Umgebung, die die Bildung von H2O2 verhindern würde. Außerhalb der Wirtszelle ist die Umgebung jedoch oxidierend und kann H2O2 sowohl innerhalb des Virus als auch im umgebenden Medium produzieren. HSV-1 würde auf diese Umgebung stoßen, wenn es von einem Wirt zum anderen übertragen wird, und Katalase kann am Schutz der HSV-1-Infektiosität während des Transports beteiligt sein. HSV-1-assoziierte Katalase kann auch Schutz vor H2O2 bieten, das von Kommensalbakterien oder anderen Quellen produziert wird. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass H2O2, das von Laktobazillen produziert wird, den weiblichen Genitaltrakt vor Krankheiten aufgrund mikrobieller Infektionen schützt (4). Aufgrund ihrer hohen katalytischen Rate könnte die virusassoziierte Katalase trotz ihrer geringen Kopienzahl (1 bis 2 Kopien pro Virion) eine Rolle beim Schutz von HSV-1 spielen. Leberkatalase zum Beispiel ist in der Lage, zig Millionen von H2O2-Molekülen pro Sekunde zu entgiften, was zu den höchsten katalytischen Raten für jedes Enzym gehört (2).

Alle Viren der Herpesfamilie haben ein Tegument, eine Proteinschicht, die zwischen dem Viruskapsid und der Membran liegt (5, 6, 9, 13). Das HSV-1-Tegument ist 40 bis 50 nm dick und besteht aus etwa 20 verschiedenen Proteinspezies, von denen fast alle im Virusgenom kodiert sind. Tegumentproteine unterscheiden sich wesentlich in ihrer Häufigkeit im Virion mit 800 Kopien oder mehr der Hauptspezies wie UL47, UL48 und UL49 (siehe Abb. 2a, Spur 3) (5, 16). Viele Tegument-Proteine sind an frühen Schritten der HSV-1-Replikation beteiligt, wie der Aktivierung der frühen Gentranskription und der Abschwächung der Wirtszell-Proteinsynthese (13, 24, 25). Das Tegument wird in das entstehende HSV-1-Virion als DNA-haltiges Kapsid und in ein Vesikel des Trans-Golgi-Netzwerks (10) eingebaut. Es wird vorgeschlagen, dass Katalase zusammen mit anderen Tegumentproteinen während des Knospungsprozesses eingebaut wird.

In nicht infizierten Zellen wird die meiste Katalase in Peroxisomen sequestriert gefunden (26). Damit es während der Tegumentation wie oben beschrieben in das Nachkommen-HSV-1 eingebaut werden kann, Katalase müsste aus Peroxisomen freigesetzt werden. Wir schlagen vor, dass dies als Folge der großflächigen Umlagerung von Zytoplasmamembranen auftreten kann, die mit der HSV-1-Replikation einhergeht (1).

Palamara et al. (19) haben gezeigt, dass eine Abnahme der zytoplasmatischen Glutathionkonzentration unmittelbar nach der Infektion von Vero-Zellen mit HSV-1 auftritt. Es wird erwartet, dass eine Abnahme der Glutathionkonzentration eine Abnahme des zytosolischen Reduktionspotentials verursacht, und diese Abnahme scheint die HSV-1-Replikation zu potenzieren. Es wurde festgestellt, dass zusätzliches Glutathion, das im Wachstumsmedium bereitgestellt wurde, das HSV-1-Wachstum antagonisiert (19). Wie extern zugesetztes Glutathion kann cytosolische Katalase das Reduktionspotential des Zytoplasmas erhöhen, indem sie H2O2 entfernt. Es wird daher vorgeschlagen, dass eine Folge der Katalase-Inkorporation in Nachkommenvirionen darin bestehen kann, das Viruswachstum zu potenzieren, indem infizierte Zellen der Katalase beraubt werden.

Die geringe Anzahl von Katalase-Molekülen pro Virion könnte erklären, warum sie in einer massenspektrometrischen Analyse ganzer HSV-1-Virionen nicht nachgewiesen wurde (7). Es gibt mehrere HSV-1-Virionproteine mit hoher Kopienzahl, die das Signal von Katalase verdecken könnten (zum Beispiel gibt es Tausende von Kopien von Glykoproteinmolekülen und 955 Kopien des Hauptkapsidproteins). Die Häufigkeit von Katalase entspricht nicht dem informellen Standard für den massenspektrometrischen Nachweis (Sichtbarkeit auf einem Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gel). Peroxiredoxin, ein peroxisomales Protein mit antioxidativer Aktivität, wurde in der massenspektrometrischen Analyse von HSV-1 nachgewiesen (7, 26).

In Zukunft könnte es möglich sein, die Empfindlichkeit von HSV-1 gegenüber den zytotoxischen Wirkungen von H2O2 auszunutzen. Es wird erwartet, dass das Virus besonders anfällig wäre, wenn es sich in einer oxidierenden Umgebung außerhalb der Wirtszelle befindet und wenn Katalase gehemmt wird.