ECUACIÓN DE WEAVER-BURK DE LÍNEA DE ANÁLISIS CINÉTICO GRÁFICA DOBLE RECÍPROCA DE CINÉTICA ENZIMÁTICA

8.3. Ecuación de Lineweaver-Burk (Gráfica de doble reciprocidad) :

En 1934, Lineweaver y Burk hicieron una simple alteración matemática en la ecuación de Michalies –Menten trazando una doble inversa de la concentración del sustrato y la velocidad de reacción.

Línea weaver Burk de la parcela se obtiene tomando el recíproco de ambos lados de la michalies–Menteris la ecuación (MME).

En la gráfica de línea weaver Burk (LB), la ecuación de Michaelis Menten se convierte en curva de línea recta.

Se utiliza para estimar la Vmax a partir de la posición de intersección en el eje X.

• La línea recta viene dada por Y = MX + C, donde C es la intersección Y de la regresión de Y en X y M es pendiente.
• Si el valor M aumenta, la pendiente aumenta.
• Si hacemos que el valor de Vmax sea igual a constante, el valor km es alto y si el valor Km es constante, el valor Vmax disminuye.

En esto, la curva hiperbólica se convierte en una línea recta y el valor absoluto de la intersección X de la línea es la afinidad (1/km) de la enzima para el sustrato. La intersección en Y es 1 / Vmax. La pendiente de la línea es Km / Vmax. De nuevo, originalmente esto se hizo subjetivamente. Es el método mucho más fino para encontrar los parámetros más adecuados para la relación Michaelis-Menten no transformada.

Aplicación

El Lineweaver–Burk de la parcela de uso para determinar el Km y Vmax. La intersección en Y de tal gráfico es equivalente a la inversa de Vmax; la intersección en X del gráfico representa -1 / km. Da una impresión visual rápida de las diferentes formas de inhibición enzimática.

8.4. Diagrama de Eadie–Hofstee

El diagrama de Eadie–Hofstee es una representación gráfica de la cinética enzimática en la que se representa la velocidad de reacción en función de la relación entre la velocidad y la concentración del sustrato:

En esta ecuación de Michaelis Menten se representa como

Invertir y multiplicar con Vmax :

Aplicación de Eadie–Hofstee Parcela

identificación Rápida de Km y Vmax

8.5. Gráfica de Hanes Woolf

La representación gráfica de la relación entre la concentración inicial del sustrato y la velocidad de reacción V se representa contra la concentración del sustrato .

ecuación de Michaelis-Menten se deriva como

Invertir y Multiplicar por :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Inhibición enzimática

Las enzimas son proteínas que actúan como catalizador de las reacciones. Pero allí la actividad es inhibida o bloqueada por las moléculas que son sustancias químicas (orgánicas / inorgánicas) en la naturaleza. Estas moléculas o compuestos se denominan inhibidores y el proceso por el cual inactivan la enzima o bloquean su actividad se denomina inhibición enzimática.

Inhiben la actividad catalítica de la enzima de forma reversible o irreversible modificando las cadenas laterales de aminoácidos necesarias para la actividad enzimática.

En el descubrimiento de fármacos, los análogos de fármacos están diseñados para la desintoxicación de muchas antitoxinas, ya que tienen acción inhibitoria.

8.6.1. Reglas seguidas de reacciones de inhibición enzimática

1. La enzima se une con el sustrato en proporción 1: 1 en el sitio activo en una disposición de llave o ajuste inducido.
2. Los compuestos inhibidores compiten con el sustrato para el sitio catalítico alostérico por orden de llegada para hacer complejos de sustrato de inhibidor de enzimas o complejos de inhibidores de enzimas.
3. La enzima y el sustrato o los inhibidores reaccionan entre sí de una manera cinética que se expresa como constantes cinéticas de una reacción catalítica.
4. Las condiciones fisiológicas como el pH, la temperatura, la concentración de sustrato o reactivos determinan la velocidad de las reacciones enzimáticas.
5. Formas intermoleculares entre subunidades enzimáticas, interacciones de grupos activos de sustrato o inhibidor, propiedades físicas de unión: naturaleza electrofílica, hidrofílica, nucleofílica y metaloproteína; el enlace de hidrógeno afecta las tasas de reacción enzimática general y el modo de inhibición.

8.6.2. Tipos de inhibición enzimática inreversible

8.6.2.1. Inhibición competitiva (Reversible): En este caso, existe competencia entre el inhibidor y el sustrato para el sitio activo.

sitio Catalítico de la enzima está ocupado por el inhibidor y su actividad es inhibida. Pero la inhibición es reversible. En este caso, se forman tanto el sustrato enzimático como el complejo inhibidor enzimático.

Efecto sobre la afinidad: – Cuando la concentración del inhibidor aumenta, su afinidad aumenta, pero la afinidad del sustrato disminuye y el valor de Km aumenta. Pero cuando la concentración de sustrato aumenta, su afinidad aumenta y la afinidad del inhibidor disminuye y el valor de km disminuye, p. ej.,

El inhibidor se une a los sitios activos de una enzima, lo que significa que el inhibidor compite con el sustrato para unirse en el sitio activo, por lo tanto, la afinidad del sustrato hacia la enzima disminuye, por lo tanto, el valor Km aumenta. El nuevo km está dada por Km, donde

donde

I = concentración de inhibidor

Kdi = constante de disociación del inhibidor.

Cuando aumenta la concentración del inhibidor, el valor km aumenta a medida que disminuye la afinidad del sustrato. Si la constante de disociación de es más, el complejo inhibidor de enzimas es más, a es menos, por lo que km es menos. El valor de a es igual a 1 o mayor que 1. El nuevo valor de Km es aKm

Efecto sobre Vmax

Vmax se calcula a una concentración infinita de sustrato.

Vmax = Kcat

A una concentración infinita de sustrato, todas las enzimas están en forma de complejo de sustrato enzimático i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b) Metotrexato :

es un inhibidor competitivo de la dihidrofolato reductasa (DHFR). Este medicamento se usa para la terapia del cáncer. Es estructuralmente similar al ácido fólico, por lo tanto, inhibe la folato reductasa competitivamente. Previene la formación de tetra hidrofolato. Por lo tanto, la síntesis de ADN se ve afectada.

(c) Inhibidores MAO (Monoamina Oxidasa):

Son, de primera clase de antidepresivos a desarrollar. Los inhibidores de la MAO aumentan el nivel de serotonina dopamina al inhibir la MAO. eg. Catecolaminas (epinefrina y norepinefrinas).

(d) Dicumarol :

Este fármaco es similar a la vitamina K. warfarin actuar como un anticoagulante por competitivamente la inhibición de la vitamina K.

8.6.3. Inhibición no competitiva

No hay competencia entre el inhibidor y el sustrato, ya que los sitios de unión del sustrato y el inhibidor son diferentes. El inhibidor no tiene similitud estructural con el sustrato, por lo tanto, no puede unirse a la enzima libre. Los inhibidores se unen al complejo de sustrato enzimático que expone el lugar de unión del inhibidor. La unión del inhibidor puede causar distorsión del sitio activo o del sitio alostérico que inactiva la catálisis.

Efecto de afinidad :

Alta afinidad del inhibidor significa bajo la disociación de la enzima sustrato complejo de enzimas sustrato. En este caso, el inhibidor se une a otro sitio activo en el complejo de sustrato enzimático. Eso significa que el inhibidor muestra afinidad por el complejo ES en lugar de por la enzima. Por lo tanto, en presencia de inhibidor, la afinidad de la enzima hacia el sustrato aumenta. Esto disminuye el Km. Por lo tanto,

Efecto sobre Vmax

Vmax se calcula en el infinito de la concentración de sustrato. A una concentración infinita de sustrato, todas las enzimas están en forma de complejo de sustrato de enzimas. El inhibidor muestra afinidad por el complejo de sustrato de enzimas. Por lo tanto, el inhibidor se une al complejo de sustrato de enzimas y previene la catálisis del complejo de sustrato enzimático en enzima y producto. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Inhibición mixta (no competitiva)

Este inhibidor no es similar al sustrato estructuralmente,pero puede unirse a la enzima libre y al complejo de subestados enzimáticos.

Cuando el inhibidor se une a la enzima lejos de los sitios activos. Induce los cambios conformacionales y reduce su actividad catalítica. Por lo tanto, los complejos inhibidores de enzimas y inhibidores de sustrato enzimático se vuelven no productivos. La concentración del sustrato no invierte la reacción. Por lo tanto, la inhibición conduce a Km inalterado pero Vmax reducido.

Lineweaver Burk de la parcela se utiliza para determinar Km y Vmax en la cinética de la enzima. La intersección en Y de un gráfico de este tipo es equivalente a la inversa de Vmax, la intersección en X del gráfico representa inhibidores competitivos, por lo tanto, las mismas intersecciones en Y (ya que Vmax no se ve afectado por los inhibidores competitivos), pero hay diferentes caídas.

El inhibidor no competitivo produce una gráfica con la misma intersección en X que Km no se ve afectado, pero diferentes pendientes con intersecciones en Y.

8.7. Cinética de la Reacción multisubstrata

En la cinética enzimática, las reacciones simples implican que un sustrato se une a una enzima y experimentan reacciones catalíticas. Esta afección no es común. La mayoría de las reacciones bioquímicas son catalizadas por dos o más sustratos que participan en las reacciones. Por ejemplo, una enzima E cataliza la reacción que involucra dos sustratos A y B y produce el producto P y Q.

Este tipo de reacción se denomina reacción Bi-Sustrato . Esta reacción puede proceder de dos maneras:

8.7.1. Secuencial

Ambos sustratos A y B, se unen a la enzima E, y luego las reacciones proceden a producir productos P y Q

Este tipo de reacción se denomina reacciones secuenciales o de desplazamiento simple que se dividen en los siguientes grupos.

Unión ordenada de sustrato o mecanismo secuencial ordenado – En este tipo, un sustrato debe unirse antes que un segundo sustrato.

Esta reacción indica la unión secuencial de sustratos, así como la liberación secuencial del producto. Este tipo de mecanismo se observa en las reacciones catalizadas por deshidrogenos de lactato que involucran NAD+ y lactato.

8.7.2. Unión aleatoria al sustrato: En este tipo, A o B pueden unirse primero a la enzima, seguido del otro sustrato y la liberación del producto.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Mecanismo de ping pong

La otra posibilidad en la reacción bi-sustrato es que un sustrato, A, se une a la enzima y al reaccionar con ella se libera un producto, P, y la enzima se convierte en una forma modificada, E’. El segundo sustrato, B, entra y se une con la enzima modificada para producir el segundo producto, Q y regenerar la enzima, E.

Las reacciones que siguen al mecanismo anterior se denominan reacciones de Ping-Pong o de doble desplazamiento. Este tipo de mecanismo se observa en reacciones catalizadas por aminotransferasas.

Estas enzimas catalizan la transferencia de un grupo amino de un aminoácido a un alfa-ceto ácido.Los productos formados son un nuevo aminoácido correspondiente al cetoácido y un nuevo cetoácido correspondiente al esqueleto de carbono del aminoácido, como:-

Otro ejemplo de reacción de ping pong es la fosfoglicerato mutasa. La enzima obtiene fosfato de un sustrato y después de la fosforilación de la enzima, el fosfato se transfiere al segundo sustrato.

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