La degeneración del disco es una afección común con una etiología multifactorial compleja. 1 Se ha propuesto una infección de bajo grado como causa de degeneración discal con acné Propionibacteriano identificado en el 84% de los pacientes con hernia discal y ciática mediante serología y cultivos. 2 También se han observado cambios moleculares, como el aumento de la producción de enzimas catabólicas (catepsina, lisozima y varias metaloproteinasas de matriz) y citoquinas inflamatorias. 3 Pacientes jóvenes con hernia discal lumbar mostraron peor recuperación después de la cirugía cuando habían mostrado concentraciones séricas elevadas de proteína C reactiva de alta sensibilidad (PCR-as) antes de la operación. Sin embargo, no está claro si los altos niveles de PCR y citoquinas inflamatorias indican una infección local o una respuesta inflamatoria a la hernia discal. 4

Los patógenos como el virus Parvo B19 o el virus de Epstein Barr (VEB) desempeñan un papel importante en la patogénesis de diversas formas de artritis. 5,6 Los virus del herpes son una familia diversa de virus de ADN de gran tamaño, todos los cuales pueden establecer infecciones latentes de por vida. La infección primaria con muchos de estos virus es común durante la infancia. 7,8

Este estudio tuvo como objetivo investigar el papel potencial de los virus del herpes, el Virus del Herpes Simple tipo 1(VHS-1), el Virus del Herpes Simple tipo 2 (VHS-2) y el Citomegalovirus (CMV) en la patogénesis de la degeneración del disco intervertebral. Un análisis molecular de muestras de discos intervertebrales obtenidas durante la discectomía mostró una frecuencia considerable de ADN de CMV y VHS-1 en discos degenerados, lo que sugiere que las infecciones virales podrían ser un factor importante en la etiología de esta enfermedad.

Pacientes y métodos

Se estudió un total de 16 pacientes consecutivos que se sometieron a una discectomía dentro de los seis meses posteriores a la hernia discal lumbar. Había ocho hombres y ocho mujeres con una edad media de 40,38 años (de 17 a 65 años). El estudio tuvo aprobación ética. El diagnóstico de hernia discal lumbar se estableció mediante examen físico y resonancia magnética. Con el fin de proporcionar un grupo control, se obtuvieron muestras de discos percutáneas de dos pacientes con fracturas de ruptura toracolumbar que estaban siendo operadas. Estos pacientes también se sometieron a un examen de RM preoperatorio para excluir la degeneración concomitante. La naturaleza de las muestras analizadas en este estudio no permitió la inclusión de más discos intervertebrales de individuos sanos por razones éticas, mientras que se abandonó la alternativa de muestras cadavéricas como controles, ya que la mayoría de la población adulta tiene antecedentes de dolor lumbar y degeneración discal.

Además del material de la hernia de disco obtenido durante la discectomía, se tomó una muestra de sangre periférica de cada paciente. Se colocaron muestras de tejido en polipropileno esterilizado 1.tubos de 5 ml y almacenados a -80 ° C, hasta la extracción de ADN/ARN y la Reacción en Cadena de la Polimerasa/ reacción en Cadena Cuantitativa de la Polimerasa (PCR/qRT-PCR). La detección de anticuerpos HSV-1 y CMV, IgM+ e IgG+ del plasma se llevó a cabo utilizando un inmunoensayo enzimático estándar.

Extracción de ADN / ARN.

El ADN genómico y el ARN total se extrajeron de las muestras de tejido utilizando el kit NucleoSpin Tissue XS y el kit NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel GmbH and Co., Düren, Alemania), respectivamente, según las instrucciones del fabricante. El ARN purificado se trató posteriormente con DNaseI para evitar cualquier contaminación del ADN. Las concentraciones de muestras de ADN y ARN se determinaron utilizando un espectrofotómetro (260 nm) antes de la amplificación de PCR o QRT-PCR.

Detección de ADN de virus herpes.

Probamos ocho virus herpes diferentes (VHS-1/-2, Virus Varicela Zóster (VVZ), VEB, CMV, Virus Herpes Humanos 6, 7 y 8 (HHV6, HHV7 y HHV8)) utilizando la Prueba RhyMA-Detección de herpes de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Euroclone, Pavia, Italia). La prueba de RhyMA se basó en la tecnología de hibridación Inversa que implicaba amplificación de ADN múltiple por PCR con cebadores biotinilados específicos, seguida de la hibridación de los fragmentos de ADN amplificados y biotinilados con tiras en sondas, específicas para cada uno de los virus del herpes. Se requirió una reacción de desarrollo final utilizando un sistema de biotina-estreptavidina para la evaluación de los resultados. También se incluyeron controles positivos y de amplificación en cada tira. Para la interpretación de los resultados, la tira desarrollada de cada muestra fue alineada con una tabla estándar. La prueba de RhyMA-Detección de herpes está autorizada para uso diagnóstico in vitro, certificando la alta especificidad y sensibilidad del ensayo. Para verificar los resultados obtenidos mediante el ensayo de detección de herpes-Prueba de RhyMA, los productos de PCR también se analizaron en un gel de agarosa de fusión baja al 3% que produce el patrón electroforético esperado para cada virus. Finalmente, las muestras PCR positivas se sometieron a un análisis de secuenciación directa, confirmando los resultados obtenidos mediante la prueba de RhyMA-Prueba de detección de herpes.

HSV – 1 y CMV qRT-PCR.

El ARN total se transcribió inversamente utilizando el kit de escritura RETRO (Ambion Inc., Austin, Texas, EE.UU.) con cebadores hexámeros aleatorios. Se probaron los ADNC para determinar la calidad de la plantilla mediante la construcción de curvas estándar utilizando diluciones en serie de cada ADNc como plantillas en QRT-PCR. Las plantillas de ADNc dieron una eficiencia de ensayo del 90% al 105%, y el R2 de todas las curvas estándar fue > 0,98. Después de la transcripción inversa, los ARNC se amplificaron utilizando cebadores específicos ICP0 e IE1 para la cuantificación de ARNM del VHS – 1 y del VHC, respectivamente, como se describió anteriormente. 9,10

Todos los QRT-PCR se realizaron por triplicado utilizando Máxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) en un detector de secuencia ABI PRISM 7500 (PE Biosystems, Foster City, Canadá), incluidas las muestras de ARN extraídas, así como los controles positivos y negativos. La fluorescencia verde SYBR se midió a lo largo de 40 ciclos de amplificación. Para cada plantilla cuantificada, se calculó el número medio del ciclo en el que la acumulación de producto entró en el intervalo lineal (TC). Los valores de TC replicados se encontraban dentro de 0,4 ciclos entre sí. El valor de CT de 18SrRNA para una plantilla dada se restó de la CT obtenida para cada ARNm de interés (ICP0 e IE1) de la misma plantilla para obtener el valor de CT normalizado (ΔCT) para cada plantilla.

Expresión génica del Factor de Necrosis tumoral α y de la interleucina-6.

Para la cuantificación de TNF-α o IL-6 ARNm, se utilizó 1 µl de ADNc junto con los cebadores mostrados anteriormente en una reacción de 20 µl, utilizando el verde SYBR como marcador para el contenido de ADN. Los cebadores utilizados fueron: actina beta: Adelante: 5 ‘- TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3’, Reverso: 5 ‘- TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3′; Adelante TNF-a: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′, Reverso: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: Delantero: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, Reverso: 5′ – GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 No hubo subproductos presentes en la reacción, como indica el patrón de disociación proporcionado al final de la reacción y la electroforesis en gel de agarosa (no se muestran datos). La eficiencia de amplificación de los productos TNF-α y IL-6 fue la misma que la de la actina beta, como indican las curvas estándar de amplificación, lo que nos permite utilizar la fórmula: aumento de pliegues = 2 – (ΔCt A-ΔCtB). Las reacciones se realizaron por triplicado para permitir la evaluación estadística.

Resultados

Se empleó un ensayo de hibridación inversa por PCR para detectar el ADN de ocho virus herpes diferentes en muestras de discos intervertebrales de pacientes con hernia discal (Fig. 1). Se detectó ADN de herpesvirus en 13 de 16 muestras (81,25%). El VHS-1 presentó la mayor prevalencia en nueve pacientes (56,25%), mientras que el CMV se detectó en seis pacientes (37,5%) (Tabla I). Dos pacientes estaban coinfectados con VHS – 1 y CMV. No se detectó ADN de VHS-2, VVZ, VEB, HHV6, HHV7 y HHV8 en las muestras de disco de ninguno de los pacientes. Ninguno de los pacientes de control (C1 y C2) dio positivo para la presencia de ADN del virus del herpes (Fig. 1).

El estado de infección por VHS-1 y CMV en las muestras de discos intervertebrales se examinó mediante la investigación de la posible expresión de transcripciones virales por RCP-qRT en Tiempo Real. La expresión génica del virus del herpes no se detectó en ninguna de las muestras analizadas, lo que demuestra la ausencia de una infección viral activa, lo que sugiere el establecimiento de una infección latente por herpesvirus en estas muestras.

También se examinó la seropositividad de los pacientes. Todos los pacientes HSV-1 o CMV PCR positivos presentaron anticuerpos IgG + para el mismo virus, respectivamente (Tabla I). En tres casos para el VHS – 1 y en seis casos para el CMV, se detectaron anticuerpos IgG+ sin prevalencia simultánea de ADN viral. Además, los anticuerpos VHS-1 y CMV IgM+ de la sangre periférica fueron negativos en todos los pacientes, lo que indica que ninguno de los pacientes había experimentado una infección aguda por el virus del herpes en el momento de la escisión quirúrgica.

Además de la indicación macroscópica de inflamación alrededor de la hernia discal, también obtuvimos evidencia experimental de inflamación en las muestras de disco intervertebral mediante el examen de los niveles de ARNm de TNF-α e IL-6, en todas las muestras utilizando QRT-PCR. El análisis mostró un aumento de aproximadamente dos a tres veces de ambos marcadores inflamatorios en las muestras en comparación con los controles (Fig. 2). Curiosamente, los pacientes coinfectados por VHS – 1 y CMV mostraron los niveles más altos de TNF-α e IL-6. Además, dos de cada tres pacientes (pacientes 2 y 8) sin evidencia de infección viral presentaron niveles más bajos de TNF-α. Esta correlación negativa no se encontró para los niveles de IL-6 en estos pacientes.

Discusión

El presente estudio sugiere el concepto de que la infección por el virus del herpes podría promover la degeneración discal. Pudimos detectar ADN de VHS-1 y CMV en un gran número de muestras de discos intervertebrales humanos recolectadas durante la discectomía.

Se ha sugerido una infección anterior de bajo grado como una posible causa de degeneración del disco. 2,4 Varios autores han destacado la relación entre las señales modicas de tipo 1 (aumento de la intensidad de la señal medular en imágenes de RM ponderadas en T2 y disminución de la intensidad de la señal en imágenes de RM ponderadas en T1 y tejido fibrovascular en las placas terminales) y la infección. 13,14 Si los pacientes no tienen dolor de espalda intenso, temperatura o un perfil sanguíneo anormal, es difícil distinguir entre los cambios Modicos 1 y la infección de bajo grado. 13,14

La relación entre infección viral y apoptosis ha sido ampliamente investigada, aclarando los mecanismos de inducción de apoptosis por virus. 15,16 Ahora se sabe que el Parvovirus B19 y particularmente su proteína NS – 1, tiene un potente efecto citotóxico en las células huésped y causa apoptosis en las células infectadas. 17 Los virus desempeñan un papel en la patogénesis de varias formas de artritis. Stahl et al 5 detectaron ADN viral de múltiples virus en tejido sinovial tomado de pacientes con artritis temprana. Un estudio reciente sugirió que las etapas avanzadas de la osteoartritis pueden estar relacionadas con un aumento de la inflamación y el daño al cartílago articular debido al Parvovirus B19. 18 En otro estudio, se propuso que el Parvovirus humano B19 está involucrado en la iniciación y perpetuación de la sinovitis en la artritis reumatoide, lo que conduce a lesiones articulares en el curso de la síntesis excesiva de citoquinas inflamatorias y enzimas proteolíticas. 19

Las infecciones por el VHS-1 son endémicas en todo el mundo. Más del 90% de los adultos tienen anticuerpos contra el VHS-1 en la quinta década. Los virus del herpes son patógenos omnipresentes en los niños, que permanecen latentes después de una infección activa. 20,21 Durante la fase inicial de la infección, la replicación viral ocurre en ganglios con supervivencia de algunas células que mantienen el genoma viral compatible con la función celular normal. Este delicado equilibrio entre las células huésped y el virus puede verse perturbado por diversos estímulos, lo que lleva a la reactivación. 22

En nuestro estudio, ninguno de los pacientes había experimentado infección aguda por herpes. Esto fue evidente tanto a nivel serológico, debido a la ausencia de anticuerpos IgM+ de la sangre periférica, como a nivel molecular debido a la falta de transcripciones de ARNm virales de las muestras de disco. Así, la alta prevalencia de infección por VHS-1 en la infancia, así como su retención en el sistema nervioso, podrían ofrecer una explicación satisfactoria de la presencia de VHS-1 y CMV en el disco intervertebral.

Surge la pregunta de cómo los virus entran en el espacio del disco intervertebral. Está bien establecido que los grandes canales vasculares cruzan las placas terminales durante la vida fetal temprana, que posteriormente disminuyen con el nacimiento y desaparecen por completo a la edad de cuatro a seis años, haciendo que el disco sea uno de los tipos de tejido avascular más grandes del cuerpo. 23 Uno podría especular que la presencia de ADN viral en el disco intervertebral es secundaria a la migración de macrófagos u otras células que contienen ADN viral en el disco durante la infancia, mientras que el entorno del disco todavía es rico en vasos sanguíneos. Otros mecanismos también podrían desempeñar un papel, ya que es bien sabido que el virus del herpes simple puede activarse en los axones neuronales por citocinas inflamatorias, como la IL-1 y el TNF-α 24,25, y a través de la migración antidroma podría involucrar el espacio discal.

Por lo tanto, el disco inflamado o lesionado, que produce una variedad de citoquinas proinflamatorias, activa virus latentes. Estos mecanismos también podrían explicar la presencia de ADN de dos o más virus en las muestras de disco. Incluso si la presencia de virus es un fenómeno secundario, su presencia puede contribuir a la patogénesis de la degeneración del disco intervertebral, ya que los antígenos virales aumentan aún más el deterioro del disco mediante la activación del medio inflamatorio que facilita la activación de los macrófagos y otras células para causar daño tisular.

En nuestro estudio, la evaluación intraoperatoria del campo quirúrgico reveló evidencia macroscópica de inflamación alrededor de la hernia discal. La evidencia de la inflamación en las muestras de disco y la contribución de la infección viral a la mejora del proceso inflamatorio provino del análisis de los niveles de ARNm de genes bien conocidos, que están asociados con la inflamación, como el TNF-α y la IL-6. Ambos marcadores inflamatorios mostraron niveles aproximadamente de dos a tres veces más altos en las muestras de los pacientes en comparación con los controles. Curiosamente, las muestras que fueron coinfectadas por el VHS-1 y el CMV exhibieron los niveles más altos de TNF-α e IL-6, lo que sugiere un efecto sinérgico de los virus. Además, los niveles de TNF-α fueron tan bajos como los casos de control entre los pacientes en los que no pudimos detectar el ADN viral.

Un artículo de revisión reciente afirma que la degeneración discal no es un diagnóstico, sino una expresión del estado del disco, que es el resultado de varios factores que actúan, individual o colectivamente. 1 En lugar de ser el resultado de un solo proceso, la degeneración del disco puede tener una serie de causas posibles, incluyendo mecánicas, envejecimiento, genéticas, sistémicas, tóxicas y/o infecciones. La ausencia de detección viral en nuestros 16 pacientes está de acuerdo con la causa multifactorial del prolapso de disco. Se sabe que los factores genéticos producen componentes anormales de la matriz 26-28 que comprometen la estructura y la función del disco y aumentan la susceptibilidad del tejido del disco al estrés mecánico. 29 Estudios epidemiológicos han demostrado que los factores genéticos aumentan el riesgo de degeneración30-35, pero no tienen en cuenta todos los casos28, 36, con variaciones entre diferentes poblaciones étnicas 37, por lo que se requieren grandes estudios de población multiétnica. 38

La presencia de virus en el disco puede crear un entorno en el que el disco sea vulnerable a daños por estrés mecánico y traumatismo. Es probable que el ADN viral esté presente a niveles de discos intervertebrales, pero las tensiones mecánicas que se postulan para contribuir a la degeneración tienen lugar a nivel lumbosacro, donde los problemas son mucho más comunes. 1 La infección de bajo grado, con o sin influencia genética, podría aumentar la susceptibilidad del disco intervertebral a factores ambientales, que impulsan de forma secundaria los eventos biológicos que resultan en degeneración del disco. Posiblemente el ADN del herpes actúa como un factor que altera las características estructurales de la matriz en el disco al modular la apoptosis y la respuesta inflamatoria local, lo que sugiere que la infección viral o la reactivación están asociadas con la enfermedad.

El descubrimiento de Marshall y Warren 39 de que la infección por Helicobacter pylori era responsable del desarrollo de úlceras gástricas condujo a un cambio importante en la comprensión médica. La posibilidad de que un proceso infeccioso pueda contribuir a la degeneración discal debe considerarse seriamente.

Creemos que este es el primer estudio que documenta la presencia de virus herpes en el disco intervertebral de pacientes con hernia discal. Se necesitan más estudios para determinar los mecanismos subyacentes y apoyar el papel potencial de los virus del herpes en la patogénesis de la enfermedad degenerativa del disco.

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