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Los virus experimentan entornos muy diferentes dependiendo de si se están replicando dentro de una célula huésped o en tránsito de un huésped a otro. Dentro de una célula, el virus y sus componentes están expuestos a un ambiente reductor, donde el potencial redox está determinado principalmente por el glutatión (18). En contraste, fuera de una célula, el virus está expuesto al oxígeno y a productos tóxicos derivados del oxígeno, como el peróxido de hidrógeno, el superóxido y el radical hidroxilo, especies reactivas que tienen el potencial de inactivar el virus. Para hacer frente a estos compuestos altamente reactivos, las plantas y los animales expresan enzimas capaces de convertirlos en productos no tóxicos. Ejemplos de tales enzimas son la catalasa, las peroxidasas y la superóxido dismutasa (28). Aquí describimos los resultados de estudios que demuestran la presencia de catalasa dentro del virión purificado del herpes simple. Luego se realizaron pruebas para determinar si la catalasa interna podía proteger el virus de la inactivación por H2O2.
Se realizaron estudios de catalasa con el virus del herpes simple 1 (VHS-1) que se cultivó en células Vero en cultivo y se purificó mediante centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa. Cuando las suspensiones del virus se ajustaron al 1% de H2O2, las burbujas de oxígeno comenzaron a formarse rápidamente, lo que indica la presencia de catalasa (Fig. 1a, tubo izquierdo). Las burbujas se hicieron visibles visualmente después de unos segundos de incubación a temperatura ambiente y continuaron formándose y agrandándose durante al menos 20 minutos. Sin embargo, no se forman burbujas si se añade el inhibidor de catalasa azida sódica a la suspensión del virus antes del tratamiento con H2O2 (Fig. 1a, derecha). Los ensayos también fueron negativos cuando (i) se eliminó el virus de la solución por centrifugación antes de la adición de H2O2 o (ii) se sustituyeron los cápsidos HSV-1 (cápsidos B) por virus intacto. En ensayos similares, no se observaron burbujas que indicaran la presencia de catalasa con el virus de la estomatitis vesicular purificada ni con el adenovirus humano 2 (datos no mostrados). El análisis de Western blot confirmó la presencia de catalasa asociada con el virus del VHS-1, pero no con adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV) o cápsidos del VHS-1 A (Fig. 1b).
Identificación de la catalasa asociada al VHS-1 mediante ensayo enzimático (a), análisis de Western blot (b) y centrifugación con gradiente de densidad de sacarosa (c). El panel a muestra un tubo que contiene VHS-1 purificado 20 minutos después de ajustar la solución al 1% de H2O2 (tubo izquierdo) y una incubación similar a la que se añadió un inhibidor de catalasa (azida de sodio de 2 mm) antes de H2O2 (derecha). Observe la formación de burbujas en el tubo izquierdo, lo que indica la presencia de catalasa en el virus. La concentración del virus fue de 0,25 mg / ml en TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) y la incubación se realizó a temperatura ambiente. El virus era la cepa KOS del VHS-1, que se cultivó en cultivos monocapa de células Vero y se purificó mediante centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa, y el título se determinó mediante dilución de punto final como se describió anteriormente (14). El panel b muestra los resultados de una prueba de Western blot para la presencia de catalasa en el VHS-1, el adenovirus humano 2 (HAd2), el virus de la estomatitis vesicular (VSV) y los cápsidos del VHS-1 A. Adenovirus humano 2 y virus de la estomatitis vesicular (Indiana; La cepa San Juan) se cultivaron en cultivos monocapa de células HeLa y Vero, respectivamente, y se purificaron mediante procedimientos descritos anteriormente (12, 17). También se utilizaron métodos publicados para la purificación de los capsidos HSV-1 A y B (23). Las principales proteínas de la cápside se detectaron mediante tinción de la mancha con Ponceau S al 1% (fila superior), mientras que la catalasa se detectó mediante inmunotinción con anticuerpos específicos para la catalasa (Calbiochem; policlonal de conejo 219010; dilución 1:5.000) (15). Tenga en cuenta que la catalasa se detectó en el virus HSV-1, pero no en HAD2, VSV o HSV-1 A capsids. El panel c muestra los resultados del análisis del gradiente de densidad de sacarosa. Se centrifugó un total de 50 µg de VHS-1 purificado en 50 µl de TNE en un gradiente de 600 µl de sacarosa del 20% al 50% en TNE. La centrifugación se realizó durante 45 minutos a 22.000 rpm en un rotor Beckman SW55 a 4°C. El gradiente se fraccionó, y las fracciones individuales se analizaron mediante SDS-PAGE, seguido de un blot sobre difluoruro de polivinilideno (PVDF) y una tinción con Ponceau S al 1%. El blot se desteñió y teñió con anticuerpos específicos para la catalasa (que migró coincidentemente con la catalasa estándar; Worthington LS001872). Tenga en cuenta que la posición del virus en el gradiente (fila superior) coincide con la de la catalasa (fila inferior), lo que sugiere que los dos están asociados.
Se realizaron experimentos de control para confirmar que la catalasa estaba asociada con el VHS – 1 y no con impurezas presentes en la preparación del virus. El VHS-1 purificado se centrifugó en una banda en un gradiente de densidad de sacarosa, el gradiente se fraccionó y se utilizó el análisis de Western blot para probar fracciones de gradiente individuales para la presencia de catalasa. Los resultados mostraron que la catalasa estaba presente en fracciones que contenían virus, pero no en fracciones flanqueadas (Fig. 1c). Los resultados se interpretan para indicar que la catalasa está asociada con el VHS-1 y no con contaminantes, como bacterias que contienen catalasa o materiales de células huésped en la preparación del virus. Dado que el genoma del VHS-1 no codifica la catalasa (22), la enzima asociada al virus debe derivarse de la célula huésped. Los primeros estudios del virus vaccinia demostraron la presencia de catalasa en el interior del virión maduro (8). Aparte de esta observación, no conocemos ningún otro informe de catalasa como componente de una estructura vírica.
El análisis posterior de la catalasa asociada al VHS-1 tuvo como objetivo determinar la ubicación de la enzima en el virión. Se realizaron dos tipos de experimentos. En primer lugar, se trató el virus purificado con la enzima proteolítica pronasa para degradar las glicoproteínas del virus y cualquier proteína no contenida en la membrana del virión. Se esperaba que las proteínas virales internas no se vieran afectadas, ya que la pronasa no cruza la bicapa lipídica del virus (16). Después del tratamiento con pronasa, el virus se recolectó por centrifugación y el grado de pérdida de catalasa se determinó mediante análisis de Western blot. Los resultados no mostraron evidencia de pérdida de catalasa en dos concentraciones de virus analizadas (ver la banda de catalasa en la Fig. 2a, carriles 1 y 2). Los controles internos demostraron que las glicoproteínas de superficie del virus gB y gH se rompieron como se esperaba (Fig. 2a; compare los carriles 2 y 3). De manera similar, el análisis de Western blot demostró que la glicoproteína D del VHS-1 fue digerida por la pronasa o la tripsina en condiciones en las que la catalasa no se vio afectada (Fig. 2b). La catalasa purificada en solución también se digirió en las mismas condiciones. Por el contrario, no hay degradación del tegumento interno (UL47, UL48 y UL49) ni de las proteínas de la cápside (UL19, UL38, UL18; Fig. 2a, carriles 1 y 2). Los resultados se interpretan para indicar que la catalasa se encuentra dentro de la envoltura del VHS-1.
Localización de la catalasa en el VHS-1 mediante tratamiento de viriones purificados con pronasa (carriles 1 a 3) y Tritón X-100 (a, carriles 4 y 5) y mediante tratamiento con pronasa y tripsina (b, carriles 1 a 3). El panel a muestra el análisis de SDS-PAGE y Western blot de proteínas presentes en el VHS-1 intacto (carriles 3 y 4) y en viriones después del tratamiento con pronasa (carriles 1 y 2) y Tritón X-100 (carril 5). Nótese que se encontró catalasa en viriones intactos (carriles 3 y 4) y en viriones tratados con pronasa (carriles 1 y 2), pero no en viriones después del tratamiento con Tritón X-100 al 1% (carril 5). El tratamiento con pronasa se llevó a cabo digiriendo el VHS-1 purificado (0,25 mg/ml) con 1 mg/ml de pronasa (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) durante 4 h a 37°C. Después del tratamiento con pronasa, el virus se volvió a aislar mediante centrifugación por gradiente de densidad de sacarosa antes del análisis de SDS-PAGE y Western blot. El tratamiento con Triton X-100 se realizó ajustando el virus purificado a Triton X-100 al 1% en tampón TNE que contenía ditiotreitol (TDT) de 10 mM y incubando durante 15 min en hielo (4°C). Los capsidos resultantes se purificaron mediante centrifugación de gradiente de sacarosa antes del análisis de SDS-PAGE y Western blot. b) Análisis de Western blot del VHS-1 purificado después del tratamiento in vitro con pronasa o tripsina. Se ajustó un total de 100 µl de VHS-1 purificado (1 mg/ml) a 2 mg/ml de pronasa o 2 mg/ml de tripsina. Una incubación de control no tenía enzima. Las mezclas se incubaron durante 2 h a 37 ° C, y los viriones se purificaron lejos de las enzimas mediante centrifugación en un gradiente de sacarosa de 20 a 50%, como se describe en la leyenda de la Fig. 1. Las muestras de virus se peletizaron por centrifugación y se examinaron mediante análisis de SDS-PAGE y Western blot. Las manchas fueron teñidas para catalasa (policlonal de conejo; véase más arriba) y glicoproteína D (anticuerpo monoclonal de ratón DL11; un regalo de Gary Cohen y Roselyn Eisenberg; 1:5.000). Tenga en cuenta que el tratamiento con proteasa causó la digestión de la glicoproteína D, pero no de la catalasa, lo que indica que la catalasa se encuentra dentro de la membrana del VHS-1.
Se obtuvo una definición más precisa de la localización de la catalasa mediante el tratamiento de virus purificados con el detergente no iónico Triton X-100 (TX-100). Cuando se lleva a cabo con virus frescos, este tratamiento causa la pérdida de la membrana del virus, las glicoproteínas de membrana y casi todas las 20 o más proteínas del tegumento (todas excepto UL36, UL37 y US3) (13, 21, 27). La cápside conserva su integridad, sin embargo, y ninguna de las principales proteínas de la cápside se pierde. El ADN del virus se retiene dentro de la cápside. Los experimentos incluyeron el tratamiento del VHS-1 con TX-100 al 1% y el aislamiento de los capsidos resultantes por centrifugación de gradiente de densidad de sacarosa. Luego se utilizó el análisis de Western blot para probar la presencia de catalasa en los cápsidos. Los resultados demostraron que las glicoproteínas del virus y las proteínas del tegumento se eliminaron como se esperaba y que la catalasa también se eliminó (ver Fig. 2a, carriles 4 y 5). Este experimento se interpreta para indicar que la catalasa está presente en el tegumento del VHS-1.
Información como la que se muestra en la Fig. 2 se puede utilizar para determinar el número de moléculas de catalasa por virión del VHS-1 (15). Esta medición se llevó a cabo a partir de dos alícuotas idénticas de virus purificado. Los dos se utilizaron para determinar (i) el número de moléculas principales de proteína de la cápside (UL19) de un gel teñido de azul de Coomassie y (ii) el número de moléculas de catalasa de 60 kDa de un Western blot calibrado. En una determinación representativa, este análisis arrojó un valor de 1:207,5 para la relación molar de catalasa a UL19. Dado que hay 955 moléculas UL19 por cápside HSV-1, se determinó que el número de moléculas de catalasa por cápside era de 955/207, 5 o 4,6. Una segunda determinación similar arrojó un valor de 7,1 moléculas de catalasa. Como hay cuatro subunidades de 60 kDa en una molécula de catalasa activa (11, 20), los resultados indican la presencia de 1 a 2 tetrámeros de catalasa por virión.
La presencia de catalasa dentro del virión del VHS-1 sugiere la posibilidad de que pueda estar involucrada en la protección del virus del daño oxidativo por H2O2. Alternativamente, la catalasa puede incorporarse pasivamente al VHS-1 a medida que el tegumento se agrega al citoplasma de la célula huésped y no tiene ninguna función protectora. Para distinguir entre las dos posibilidades, examinamos la sensibilidad del VHS-1 purificado a la inactivación por H2O2in vitro. El VHS-1 se trató con H2O2 en presencia o ausencia del inhibidor de la catalasa azida sódica (NaN3), y el título del virus se determinó posteriormente (en ausencia del inhibidor de la catalasa). Los resultados mostraron que, si bien el H2O2 de 50 mm produjo una disminución modesta del título (de 3 a 4 veces), se observó un efecto letal de 106 veces o más si estaba presente NaN3 (Tabla 1). Los experimentos de control mostraron poca destrucción del VHS-1 por NaN3 solo (Tabla 1). Los resultados se interpretan para indicar que la catalasa proporciona un nivel significativo de protección contra la inactivación del VHS-1 por H2O2.
la Tabla 1
título de Virus después del tratamiento con H2O2 con o sin un inhibidor de la catalasa (NaN3)al un
| Tratamiento | Título | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| El tiempo en 10 mM de H2O2 | Tiempo en 50 mM de H2O2 | |||||
| Ninguno | 2 h | 20 h | Ninguno | 2 h | 20 h | |
| No NaN3 | 28 × 1010 | 60 × 1010 | 8 × 1010 | 28 × 1010 | 10 × 1010 | 8 × 1010 |
| 2 mM NaN3 | 30 × 1010 | 6 × 1010 | <104 | 30 × 1010 | 1 × 1010 | <104 |
No se espera que el VHS-1 necesite ser protegido del daño oxidativo por H2O2 mientras esté asociado con una célula huésped. Como se describió anteriormente, se encuentra un ambiente reductor dentro de la célula, y eso evitaría la formación de H2O2. Sin embargo, fuera de la célula huésped, el ambiente es oxidante, capaz de producir H2O2 tanto dentro del virus como en el medio circundante. El VHS-1 se encontraría con este entorno a medida que se transmite de un huésped a otro, y la catalasa podría estar involucrada en la protección de la infectividad del VHS-1 durante el tránsito. La catalasa asociada al VHS – 1 también puede proporcionar protección contra el H2O2 producido por bacterias comensales u otras fuentes. Por ejemplo, se ha demostrado que el H2O2 producido por lactobacilos protege el tracto genital femenino de enfermedades debidas a infecciones microbianas (4). Debido a su alta tasa catalítica, la catalasa asociada al virus podría tener un papel en la protección del VHS-1 a pesar de su bajo número de copias (1 a 2 copias por virión). La catalasa hepática, por ejemplo, es capaz de desintoxicar decenas de millones de moléculas de H2O2 por segundo, una de las tasas catalíticas más altas reportadas para cualquier enzima (2).
Todos los virus de la familia del herpes tienen un tegumento, una capa de proteína que se encuentra entre la cápside del virus y la membrana (5, 6, 9, 13). El tegumento del VHS-1 tiene un grosor de 40 a 50 nm y consta de aproximadamente 20 especies de proteínas distintas, casi todas las cuales están codificadas en el genoma del virus. Las proteínas del tegumento difieren sustancialmente en su abundancia en el virión con 800 copias o más de las especies principales, como UL47, UL48 y UL49 (ver Fig. 2a, carril 3) (5, 16). Muchas proteínas del tegumento están involucradas en los primeros pasos de la replicación del VHS – 1, como la activación de la transcripción temprana de genes y la atenuación de la síntesis de proteínas de la célula huésped (13, 24, 25). El tegumento se ensambla en el naciente virión HSV-1 como capullos que contienen ADN en una vesícula de la red trans-Golgi (10). Se sugiere que la catalasa se incorpora junto con otras proteínas del tegumento durante el proceso de brotación.
En las células no infectadas, la mayoría de la catalasa se encuentra secuestrada en los peroxisomas (26). Para que se incorpore a la progenie HSV-1 durante la tegumentación como se describió anteriormente, la catalasa tendría que liberarse de los peroxisomas. Sugerimos que esto puede ocurrir como consecuencia del reordenamiento a gran escala de las membranas citoplasmáticas que acompañan la replicación del VHS-1 (1).
Palamara et al. (19) han demostrado que una disminución en la concentración de glutatión citoplasmático se produce rápidamente después de que las células Vero se infectan con el VHS-1. Se espera que una disminución en la concentración de glutatión cause una disminución en el potencial reductor citosólico, y esta disminución parece potenciar la replicación del VHS-1. Se encontró que el glutatión adicional proporcionado en el medio de crecimiento antagoniza el crecimiento del VHS-1 (19). Al igual que el glutatión agregado externamente, la catalasa citosólica puede aumentar el potencial reductor del citoplasma al eliminar el H2O2. Por lo tanto, se sugiere que una de las consecuencias de la incorporación de catalasa en viriones de la progenie puede ser potenciar el crecimiento del virus privando de catalasa a las células infectadas.
El pequeño número de moléculas de catalasa por virión puede explicar por qué no se detectó en un análisis espectrométrico de masas de viriones HSV-1 completos (7). Hay varias proteínas de virión HSV-1 de alto número de copias que podrían ocultar la señal de la catalasa (por ejemplo, hay miles de copias de moléculas de glicoproteína y 955 copias de la proteína principal de la cápside ). La abundancia de catalasa no cumple con el estándar informal para la detección por espectrometría de masas (visibilidad en un gel SDS-PAGE teñido con Coomassie). La peroxiredoxina, una proteína peroxisomal con actividad antioxidante, se detectó en el análisis espectrométrico de masas del VHS-1 (7, 26).
En el futuro, puede ser posible explotar la sensibilidad del VHS-1 a los efectos citotóxicos del H2O2. Se espera que el virus sea especialmente vulnerable cuando se encuentra en un entorno oxidante fuera de la célula huésped y cuando se inhibe la catalasa.
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