I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
entsymaattiset reaktiot: (kuvat avautuvat uudessa ikkunassa)

• polymerointi
• oikoluku
• Primer poisto

DNA polymeraasi I osallistuu DNA: han prokaryoottien replikaatio. DNA-ketjun kasvu on 5-3′ suuntaan ja additio 3 ’ – hydroksyylipäässä. Uusi ketju on pohja-pariksi mallin kanssa, ja uusi ketju ja malli ovat vastakkaisia. DNA polymeraasi I on runsain polymeraasi, ja se toimii täyttämään DNA: ssa olevia aukkoja, joita syntyy DNA: n replikaation, korjauksen ja rekombinaation aikana.

historia:

DNA-polymeraasi I: n löysivät Arthur Kornberg et al. vuonna 1956. Hänen alustavat tuloksensa esiteltiin ensimmäisen kerran Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) – järjestön vuosikokouksessa vuonna 1956 Atlantic Cityssä, New Jerseyssä. Arvioijat hänen alkuperäisen paperin ehdotti, että kirjoittajat viittaavat tuotteen ”polydeoksiribonukleotidi” eikä ”DNA”; ”DNA” hyväksyttiin vasta päätoimittaja John Edsallille tehdyn valituksen jälkeen (Friedberg 2006). Kaksi muuta papereita julkaistiin vuonna 1958 Lehman et al. ja Bessman ym., joka lopullisesti vahvisti DNA-polymeraasin suorittaneen DNA-replikaation. Kornberg sai Nobelin palkinnon vuonna 1959 DNA-polymeraasi I: n löytämisestä

vuonna 1969, Jovin et al. aminohappokoostumus selvitetty (Jovin et al. 1969a, b). Samana vuonna DeLucia ja Cairns eristivät E. coli-kannassa oli mutaatio, joka vaikutti DNA-polymeraasiin ja yllättäen selvisi, että mutantti syntetisoi DNA: ta normaalisti. Tämä löytö herätti epäilyksiä DNA-polymeraasin roolista replikaatiossa ja sai ryhmät etsimään muita replikaatioentsyymejä. Samaan aikaan Klenow ja kollegat osoittivat, että DNA-polymeraasin hoito proteolyyttisellä subtilisiini-entsyymillä (tyyppi Carlsberg) johti polymeraasiaktiivisuuden lisääntymiseen ja eksonukleaasiaktiivisuuden vähenemiseen. Tuloksena saatu DNA-polymeraasi eristettiin ja nimettiin ”Klenowin fragmentiksi” (Klenow and Henningsen 1970a, ja Klenow and Overgaard-Hansen 1970).

vuonna 1970 eristettiin E. colin DNA-polymeraasi II, jonka tunnisti Arthur Kornbergin poika Thomas Kornberg (Kornberg and Gefter 1970). DNA-polymeraasi II: sta raportoivat itsenäisesti myös Knippers sekä Moses ja Richardson vuonna 1970 (Moses ja Richardson 1970b). Vuotta myöhemmin Thomas Kornberg ja Gefter tunnistivat DNA-polymeraasi III: n (Kornberg and Gefter 1971).

viimeaikaisiin DNA-polymeraasi I: n tutkimuksiin on kuulunut substraattispesifisyyden molekyylipohjan tutkiminen termodynaamisilla tutkimuksilla (Wowor et al. 2010)ja yksimolekyyliset FRET-kokeet (Santoso et al. 2010). Hastings ym. ovat tutkineet viiden E. coli DNA polymeraasin yhteisvaikutuksia solustressin aikana (Hastings et al. 2010), ja Kukreti et al.tutkimuksissa on pyritty selvittämään, mitkä jäämät ovat tärkeitä 3′ -5 ’ – eksonukleaasiaktiivisuudelle (Kukreti et al. 2008).

spesifisyys:

DNA-synteesi vaatii primer-juosteen, jonka vapaa 3′ – hydroksyyliterminaali on hehkutettu DNA-templaattijuosteelle ja deoksinukleotiditrifosfaatit muodostavat emäspareja templaatin kanssa. Additio on 5-3-suunnassa pyrofosfaatin vapautuessa. Entsyymi on aktiivinen DNAs: issä, joissa on yksijuosteisia aukkoja, ja myös DNAs: issä, joissa on yksijuosteisia katkoksia tai nirhaumia. Joissakin olosuhteissa RNA-DNA-hybridit ja RNA-duplex voivat toimia template-primerina (Setlow 1972).

DNA-polymeraasi I: een liittyvä 5′ – 3′ – eksonukleaasiaktiivisuus hajottaa sekä yksi-että kaksisäikeistä DNA: ta 5′ – 3′ – suunnassa, jolloin saadaan 5′ – mononukleotideja. 5′-3′ – eksonukleaasiaktiivisuus on spesifinen kaksijuosteiselle DNA: lle, josta saadaan 5 ’ – mononukleotideja ja oligonukleotideja. DNA-polymeraasi I voi myös poistaa DNA: n Epäsuhtaiset alueet (Setlow 1972).

DNA-polymeraasien samanlainen rakenne on osoittanut, että useimmat DNA-polymeraasientsyymit käyttävät identtistä kahta metalli-ionikatalysoitua polymeraasimekanismia. Yksi metalli-ioni aktivoi primerin 3 ’ – OH: n hyökkäykseen dNTP: N A-fosfaattia vastaan. Toinen metalli-ioni stabiloi lähtevän hapen negatiivisen varauksen ja kelatoi b-ja g-fosfaatit (Steitz 1999).

Klenow-fragmentti on E. colin DNA-polymeraasi I: n proteolyyttinen tuote, joka säilyttää polymeroitumisen ja 3′ – 5′ eksonukleaasiaktiivisuuden, mutta on menettänyt 5′ – 3′ eksonukleaasiaktiivisuuden.

koostumus:

DNA-polymeraasi I on vallitseva E. colissa esiintyvä polymeroiva entsyymi. Se sisältää yhden disulfidisidoksen ja yhden sulfhydryyliryhmän (Jovin et al. 1969b). Viisi erillistä DNA-polymeraasia on eristetty E. coli-bakteerista, ja niille on annettu nimet I, II, III, IV ja V. DNA-polymeraasi I: n tehtävänä on täyttää DNA-aukot, jotka syntyvät DNA: n replikaation, korjauksen ja rekombinaation aikana. DNA-polymeraasi II toimii myös editoinnissa ja oikoluvussa lähinnä viiveen juosteessa (Kim et al. 1997, Wagner ja Nohmi 2000). DNA-polymeraasi III on tärkein replikatiivinen entsyymi. DNA-polymeraasi IV: llä ja V: llä on suuret aktiiviset kohteet, jotka mahdollistavat enemmän emäsvirheitä ja ovat siksi virhealttiimpia. Heiltä puuttuu myös oikoluku-eksonukleaasialayksiköt virheellisten ilmoitusten korjaamiseksi (Nohmi 2006, and Hastings et al. 2010). DNA-polymeraasi V esiintyy merkittävinä pitoisuuksina vain SOS-indusoiduissa soluissa ja yliekspressio rajoittaa DNA-synteesiä (Marsh and Walker 1985).

kaikkien niiden polymeraasien, joiden rakenteet tunnetaan, domeenimuotoa on kuvattu ”oikeaksi kädeksi”, jolla on ”peukalo”, ”kämmen” ja ”sormi” – domeenit (Kohlstaedt et al. 1992). Kämmenen alueen arvellaan katalysoivan fosforyylin siirtoa, ja sormen alueen arvellaan vuorovaikuttavan saapuvan nukleosiditrifosfaatin ja sen muodostaman mallipohjan kanssa. Peukalon uskotaan auttavan DNA: n paikantamisessa ja translokaatiossa (Brautigam and Steitz 1998).

Molekyyliominaisuudet:

DNA-polymeraasi I: tä (polA) koodaava geeni sisältää noin 3 000 emäsparia ja koodaa noin 1 000 aminohappojäämää yksinkertaisessa polypeptidiketjussa. Jopa miljardien vuosien evoluution erottamat eliöt (kuten Deinococcus-Thermus-suvut ja E. coli) on noin 35% aminohappo identiteetti ja noin 50% homologia (Patel et al. 2001).

proteiinin Liittymisnumero: P00582

molekyylipaino:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Klenow-fragmentti: 70 kDa (geelisuodatus, Klenow and Overgaard-Hansen 1970)

optimaalinen pH:

• Maksimiaktiivisuus saadaan pH 7.4: ssä kaliumfosfaattipuskurilla natiivi-DNA: ta tai poly dAT-template-primer-järjestelmiä varten (Richardson et al. 1964)
• Klenow-fragmentti: Maksimiaktiivisuus saadaan fosfaattipuskurilla 7,4 ja 8.4 Tris-HCl-puskurilla

isoelektrinen Piste:

Ekstinktiokerroin:

aktivaattorit:

• aktiivisuudelle
• Mg2+ pitoisuudella, joka on 7 mM, saadaan optimaalinen aktiivisuus standardimäärityksen olosuhteissa (Richardson et al. 1964)
• MN2+ voi osittain täyttää metalli-ionivaatimuksen
• Entsyymiaktiivisuuteen vaikuttavat myös monovalenttien kationien kuten K+, Rb+, Cs+ ja NH4+

estäjien pitoisuudet:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• korkea radioaktiivisuuden prosenttiosuus nick translation-määrityksissä
• Standardivertailumateriaali DNA-polymeraasitutkimusta varten
• vaihtoehtoisten kopolymeerien, kuten poly d(A-T), ja homopolymeerien, kuten poly dG-poly dC
• Klenow fragment: DNA sequencing (Sanger et al. 1977), 5′ ulokkeiden täyttäminen ja 3′: n ulokkeiden poistaminen tylpän pään muodostamiseksi (Sambrook 1989) ja toinen säikeiden synteesi mutageneesissä (Gubler 1987)