Taq polymeraasi on yksi ubikvitäärisimmistä entsyymeistä molekyylibiologiassa. Sen jälkeen kun Taq löydettiin vuonna 19651, siitä on tullut PCR: n ja kaikkien teknologian mahdollistamien jatkojalostussovellusten selkäranka. Tämä voimakas polymeraasi on oletusvalinta useimmissa vahvistus-ja kloonausmenettelyissä sekä diagnostisissa testeissä, markkerigeenin DNA-sekvensoinnissa ja paljon muuta.

mikä tekee Taq-polymeraasista niin erikoisen? Tämän päivän artikkelissa tarkastelemme Taq: n etuja ja haittoja, mitä tarvitset saadaksesi parhaat PCR-tulokset Taq-polymeraasista ja joitakin Taq-johdannaisia, jotka voivat auttaa sinua saavuttamaan parempia tuloksia erikoistuneissa sovelluksissa.

miksi Taq: ta käytetään niin laajalti PCR: ssä?

Taqin suosiosta hyötyy se, että se oli ensimmäinen molekyylibiologien löytämä korkean lämpötilan polymeraasi. Mutta, se on kaukana ainoa syy se on edelleen niin suuri kysyntä tänään.

Taq-polymeraasin tärkeä ominaisuus on stabiili jopa 95°C2: n lämpötilassa. Se on tärkeää, koska tämä on lämpötila, jossa DNA denaturoituu – vaadittu vaihe PCR-reaktion alussa. Vaikka mikä tahansa kohtalaisen lämpötilan polymeraasi myös denaturoituisi siinä lämpötilassa, tehden siitä hyödyttömän, Taq on täysin valmis aloittamaan kohde-DNA-näytteen polymeroinnin.

tämän lisäksi Taq: n etuna on se, että se on aktiivisimmillaan 70-80°C: n lämpötilavälillä2. Se on niin kuumaa, ettei DNA: ta synny uudelleen, – mutta alemmissa lämpötiloissa hehkuneet primerit eivät myöskään irtoa. Taq-polymeraasi toimii siis erittäin hyvin useimpien tavanomaisten PCR-reaktioiden vaatimissa lämpötiloissa.

lopulta Taq sopii erittäin hyvin molekyylibiologian perustarpeisiin. Polymeraasista jää a-pyrstötuotteita, jotka voidaan helposti kloonata vektoriksi tavallisen TA-kloonaussarjan avulla. Taq kestää myös suhteellisen hyvin DNA-sekvenssejä, joilla on laaja valikoima GC-pitoisuuksia, eikä se ole kovin nirso kohde-DNA: n tai dNTP: n pitoisuuksien suhteen.

mitä Taq tarvitsee Polymerisoituakseen tehokkaasti?

Jos DNA-näytteeseen lisättäisiin vain Taq-polymeraasia yksinään, ei tapahtuisi paljoa. Tämä johtuu siitä, kuten useimmat entsyymit, Taq tarvitsee erikoistuneen reagenssiseoksen toimiakseen kunnolla.

Taq-peruspuskuriin kuuluvat kaliumkloridi, Tris-hydrokloridi ja Triton X-100. Näillä kemikaaleilla ei ole yhtä suurta merkitystä PCR – reaktioiden optimoinnissa kuin Taq: n säilyttämisessä turvallisena pakastimessa-mikä itsessään on tärkeää PCR-reseptoreista saatavan parhaan hyödyn kannalta. Vaikka voit tehdä oman puskurisi rehydratoidaksesi ja varastoidaksesi kylmäkuivattua Taq-entsyymiä, valtaosa polymeraasista myydään pääasiallisena sekoituksena, jossa Taq on jo suspendoitu vaadittuun puskuriliuokseen.

PCR-reaktioille kriittisempi on magnesiumkloridi. Magnesium on välttämätön kofaktori Taq-polymeraase3: lle. Ilman sitä Taq ei pysty katalysoimaan nukleotidien lisäämistä primeriin tai kasvavaan DNA-juosteeseen. Myös magnesiumin pitoisuudella on merkitystä. Kun PCR-reaktioon lisätään enemmän magnesiumia, Taq: sta tulee aktiivisempi, mutta myös vähemmän spesifinen polymeroitaessa vain kohde-DNA-juostetta.

magnesiumin pitoisuusriippuvaisen roolin vuoksi löytyy Taq master-sekoituksia, joissa magnesium on jo mukana, sekä sekoituksia, jotka jättävät sen pois. Jälkimmäisessä tapauksessa sinun on lisättävä magnesiumkloridia erikseen (mikä vaatii ylimääräisen pipetointivaiheen valmisteltaessa PCR: ää). Etuna on, että voit hallita magnesiumin tarkkaa pitoisuutta, joten voit kokeilla löytää optimaalisin sekoitus Taq-tuottavuutta ja spesifisyyttä.

mitä ongelmia Taq-polymeraasilla on?

Taq: ta käytetään laajalti rutiininomaisissa PCR: issä, mutta valitettavasti se ei ole täydellinen kaikkiin sovelluksiin. Merkittävin haittapuoli Taq on, että se ei ole tarkin polymeraasi siellä. Taq: n virhetaso on noin yksi virhe 100 000 perusparia kohti 4. Vertailun vuoksi PFU oikolukupolymeraasi on noin 10 kertaa tarkempi. Jos käytät PCR: ää ennen kloonausta tai DNA-sekvensointia, ero virhetaajuudessa voi olla hyvin merkittävä.

standardilla Taq-polymeraasilla voi olla ongelmia myös noin 1 kB pitempien kohde-DNA-sekvenssien vahvistamisessa. Verrattuna muihin polymeraasityyppeihin Taq: lla on alhainen processivity, mikä tarkoittaa, että sen tehokkuus heikkenee merkittävästi amplikonin pituuden myötä. Tämä alhainen processivity voidaan pahentaa läsnäolo PCR-estäjät, jotka ovat yleisiä, jos työskentelet DNA uutetaan kudoksista, kasveista tai maaperästä.

lopuksi, vaikka Taq-polymeraasi on tehokkainta yli 70°C: n lämpötilassa, entsyymi toimii edelleen alle 50°C: n lämpötilassa.tämä on ongelmallista, koska Taq voi vahingossa polymeroida alukkeita tai ei-kohde-DNA-sekvenssejä, kun PCR-reaktion lämpötila laskee, jotta alukkeet voivat hehkuttaa kohdesekvenssiä. Tämän seurauksena Taq: n tiedetään tuottavan primer-dimeerejä ja muita ei-toivottuja tuotteita, jotka voivat olla tiellä tuotantoketjun loppupään sovelluksissa, kuten kloonauksessa.

erikoistuneet Taq-polymeraasit kehittyneisiin sovelluksiin

onneksi on olemassa erikoistuneita Taq-polymeraasin muotoja, jotka ratkaisevat osan näistä ongelmista. Esimerkiksi highQu ALLin Taq polymeraasi on synteettinen versio Taq: sta, joka on processivitympi kuin tavallinen Taq. Tämän seurauksena voit helpommin saavuttaa amplikon-tuotokset korkean GC: n malleista, yli 1 kB: n pituisista malleista ja näytteistä, joilla on kohtalainen inhibiittoripitoisuus.

toinen yleinen Taq-muoto, kuten Allin Hot Start Taq, on suunniteltu molekyylinestäjällä, jotta se ei olisi aktiivinen alemmissa lämpötiloissa. Kuumakäynnistys Taq toimii vasta kuumennettaessa 95°C: seen, mikä vähentää merkittävästi primer-dimeerien ja epäspesifisten amplikonien muodostumista polymeroinnin seurauksena ennen PCR-reaktioiden alkamista. Tämän seurauksena voit saada korkeampia tuottoja, kun työskentelet pidemmillä kohdesarjoilla ja vähentää Tausta-amplikoneja, jotka yleensä vaativat puhdistusta.

johtopäätös

Taq-polymeraasi on ollut pitkään valittu entsyymi sekä rutiininomaisissa että monimutkaisissa PCR-sovelluksissa. Se sopii täydellisesti PCR-reaktion vaatimuksiin, kun taas sen loppupään sovellukset, kuten Kloonaus ja sekvensointi, ovat yksinkertaisia. Vaikka standardi Taq on joitakin haittoja, nämä ovat suurelta osin ratkaistu käyttämällä suunniteltu tai hot start Taq polymeraasi. Suurimmassa osassa sovelluksista Taq-polymeraasi on edelleen molekyylibiologien go-to-entsyymi.

1 Ishino s, Ishino Y. 2014. Frontiers in Microbiology 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostic Molecular Pathology: a Guide to Applied Molecular Testing.

3 Williams M. 2018. Iskelmä

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.