ANALYSE CINÉTIQUE LIGNE ÉQUATION DE WEAVER-BURK DOUBLE GRAPHIQUE RÉCIPROQUE DE LA CINÉTIQUE ENZYMATIQUE

8.3. Équation de Lineweaver-Burk (Double graphique réciproque):

En 1934, Lineweaver et Burk ont apporté une simple modification mathématique à l’équation de Michalies–Menten en traçant un double inverse de la concentration du substrat et de la vitesse de réaction.

Le tracé de Burk de tisserand de ligne est obtenu en prenant l’inverse des deux côtés de l’équation de michalies–Menteris (MME).

Dans le tracé de Burk (LB) de tisserand linéaire, l’équation de Michaelis Menten est convertie en courbe droite.

Il est utilisé pour estimer la Vmax à partir de la position d’interception sur l’axe des Abscisses.

• La droite est donnée par Y= MX +C, où C est l’ordonnée à l’origine de la régression de Y sur X et M est la pente.
• Si la valeur M augmente, la pente augmente.
• Si la valeur de Vmax est égale à constante, la valeur Km est élevée et si la valeur Km est constante, la valeur Vmax diminue.

Dans ce cas, la courbe hyperbolique devient une droite et la valeur absolue de l’interception X de la droite est l’affinité (1 / Km) de l’enzyme pour le substrat. L’ordonnée à l’origine est 1/Vmax. La pente de la ligne est Km / Vmax. Encore une fois, à l’origine, cela a été fait subjectivement. C’est la méthode la plus fine pour trouver les paramètres les mieux adaptés à la relation de Michaelis-Menten non transformée.

Application

Le tracé Lineweaver-Burk permet de déterminer le Km et le Vmax,. L’ordonnée à l’origine d’un tel graphe est équivalente à l’inverse de Vmax ; l’ordonnée à l’origine du graphe représente -1/Km. Il donne une impression visuelle rapide des différentes formes d’inhibition enzymatique.

8.4. Diagramme d’Eadie–Hofstee

Le diagramme d’Eadie–Hofstee est une représentation graphique de la cinétique enzymatique dans laquelle la vitesse de réaction est tracée en fonction du rapport entre la vitesse et la concentration du substrat:

Dans cette équation de Michaelis Menten est représentée par

Inverser et multiplier avec Vmax :

Application du tracé Eadie–Hofstee

Identification rapide du Km et du Vmax

8.5. Graphique de Hanes Woolf

Une représentation graphique du rapport entre la concentration initiale du substrat et la vitesse de réaction V est tracée en fonction de la concentration du substrat.

L’équation de Michaelis-Menten est dérivée de

Inverser et multiplier par :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Inhibition enzymatique

Les enzymes sont des protéines agissant comme catalyseur des réactions. Mais l’activité y est inhibée ou bloquée par les molécules qui sont des substances chimiques (organiques / inorganiques) de nature. Ces molécules ou composés sont appelés inhibiteurs et le processus par lequel ils inactivent l’enzyme ou bloquent son activité est appelé inhibition de l’enzyme.

Ils inhibent l’activité catalytique de l’enzyme de manière réversible ou irréversible en modifiant les chaînes latérales des acides aminés nécessaires à l’activité enzymatique.

Dans la découverte de médicaments, les analogues de médicaments sont conçus pour la détoxification de nombreuses antitoxines car ils ont une action inhibitrice.

8.6.1. Règles suivies de réactions d’inhibition enzymatique

1. L’enzyme se lie au substrat dans un rapport de 1:1 au site actif dans un arrangement clé-serrure ou un ajustement induit.
2. Les composés inhibiteurs rivalisent avec le substrat pour le site catalytique allostérique sur la base du premier arrivé premier pour créer un complexe de substrat d’inhibiteur enzymatique ou des complexes d’inhibiteur enzymatique.
3. L’enzyme et le substrat ou les inhibiteurs réagissent l’un avec l’autre d’une manière cinétique qui est exprimée en constantes cinétiques d’une réaction catalytique.
4. Des conditions physiologiques telles que le pH, la température, la concentration du substrat ou des réactifs déterminent la vitesse des réactions enzymatiques.
5. Formes intermoléculaires entre sous-unités enzymatiques, interactions de groupe actif de substrat ou d’inhibiteur, propriétés physiques de nature de liaison : nature électrophile, hydrophile, nucléophile et métalloprotienne; la liaison hydrogène affecte les taux de réaction enzymatique globaux et le mode d’inhibition.

8.6.2. Types d’inhibition enzymatique inreversible

8.6.2.1. Inhibition compétitive (réversible): En cela, une compétition existe entre l’inhibiteur et le substrat pour le site actif.

Le site catalytique de l’enzyme est occupé par un inhibiteur et son activité est inhibée. Mais l’inhibition est réversible. Dans ce cas, un substrat enzymatique et un complexe inhibiteur enzymatique sont formés.

Effet sur l’affinité: – Lorsque la concentration en inhibiteur augmente, son affinité augmente mais l’affinité du substrat diminue et la valeur Km augmente. Mais lorsque la concentration en substrat augmente, son affinité augmente et l’affinité de l’inhibiteur diminue et la valeur Km diminue, c’est-à-dire,

L’inhibiteur se lie aux sites actifs d’une enzyme, ce qui signifie que l’inhibiteur est en compétition avec le substrat pour se lier au site actif, donc l’affinité du substrat envers l’enzyme diminue et la valeur Km augmente. Le nouveau km est donné par Km, où

où

I = concentration de l’inhibiteur

Kdi = constante de dissociation de l’inhibiteur.

Lorsque la concentration en inhibiteur augmente, la valeur km augmente à mesure que l’affinité du substrat diminue. Si la constante de dissociation de est plus, complexe inhibiteur enzymatique plus, a est moins donc km est moins. La valeur de a est égale à 1 ou supérieure à 1. La nouvelle valeur de Km est aKm

Effet sur Vmax

Vmax est calculé à une concentration infinie de substrat.

Vmax=Kcat

À une concentration infinie de substrat, toutes les enzymes se présentent sous la forme d’un complexe de substrat enzymatique i.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(b)Méthotrexate:

C’est un inhibiteur compétitif de la dihydrofolate réductase (DHFR). Ce médicament est utilisé pour le traitement du cancer. Il est structurellement similaire à l’acide folique, inhibe donc la folate réductase de manière compétitive. Il empêche la formation de tétra hydrofolate. Par conséquent, la synthèse de l’ADN est subie.

(c) Inhibiteurs de la MAO (Mono Amine Oxydase):

Ce sont, première classe d’antidépresseurs à développer. Les inhibiteurs de la MAO augmentent le niveau de sérotonine dopamine en inhibant la MAO. par exemple. Catécholamines (épinéphrine et norépinéphrines).

(d) Dicumarol:

Ce médicament est similaire à la vitamine K. La warfarine agit comme anticoagulant en inhibant de manière compétitive la vitamine K.

8.6.3. Inhibition non compétitive

Il n’y a pas de compétition entre l’inhibiteur et le substrat car les sites d’attache du substrat et de l’inhibiteur sont différents. L’inhibiteur n’a pas de similitude structurelle avec le substrat, donc ne peut pas se lier à l’enzyme libre. Les inhibiteurs se lient au complexe de substrat enzymatique qui expose le site de liaison de l’inhibiteur. La liaison d’un inhibiteur peut provoquer une distorsion du site actif ou du site allostérique qui inactive la catalyse.

Effet sur l’affinité:

Une affinité élevée de l’inhibiteur signifie une faible dissociation du complexe de substrat enzymatique en substrat d’enzymes. En cela, l’inhibiteur se lie à un autre site alors actif sur le complexe de substrat enzymatique. Cela signifie que l’inhibiteur montre une affinité pour le complexe ES plutôt que pour l’enzyme. Ainsi en présence d’inhibiteur l’affinité de l’enzyme vis-à-vis du substrat augmente. Cela diminue le Km. Par conséquent,

L’effet sur Vmax

Vmax est calculé à une concentration infinie de substrat. À une concentration infinie de substrat, toutes les enzymes se présentent sous la forme d’un complexe de substrat d’enzymes. L’inhibiteur montre une affinité pour le complexe de substrat d’enzymes. Ainsi, l’inhibiteur se lie au complexe de substrat d’enzymes et empêche la catalyse du complexe de substrat d’enzymes en enzyme et en produit. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Inhibition mixte (non compétitive)

Cet inhibiteur n’est pas similaire au substrat structurellement mais peut se lier à l’enzyme libre et au complexe de sous-état d’enzyme à la fois.

Lorsque l’inhibiteur se lie à l’enzyme loin des sites actifs. Il induit les changements conformationnels et réduit son activité catalytique. Ainsi, les complexes inhibiteur d’enzymes et inhibiteur de substrat d’enzymes deviennent non productifs. La concentration en substrat n’inverse pas la réaction. Par conséquent, l’inhibition conduit à un Km inchangé mais à une Vmax réduite.

Le tracé de Burk de Lineweaver est utilisé pour déterminer Km et Vmax en cinétique enzymatique. L’ordonnée à l’origine d’un tel graphe est équivalente à l’inverse de Vmax, l’ordonnée à l’origine X du graphe représente les inhibiteurs compétitifs d’où les mêmes interceptions Y (car Vmax n’est pas affecté par les inhibiteurs compétitifs) mais il existe des slops différents.

Un inhibiteur non compétitif produit un tracé avec la même interception X que Km n’est pas affecté mais des pentes différentes avec des interceptions Y.

8.7. Cinétique de la réaction Multisubstrate

Dans la cinétique enzymatique, les réactions simples impliquent qu’un substrat se lie à une enzyme et subisse des réactions catalytiques. Cette condition n’est pas courante. La majorité des réactions biochimiques catalysées par deux substrats ou plus participant aux réactions. Par exemple, une enzyme E, catalyse la réaction impliquant deux substrats A et B et donne le produit P et Q.

Ce type de réaction est appelé réaction Bi-Substrat. Ces réactions peuvent se dérouler de deux manières :

8.7.1.

Séquentiel

Les substrats A et B se lient à l’enzyme E, puis les réactions aboutissent à des produits P et Q

Ce type de réaction est appelé réactions séquentielles ou à déplacement simple qui sont ensuite divisées en groupes suivants.

Liaison de substrat ordonnée ou mécanisme séquentiel ordonné – Dans ce type, un substrat doit se lier avant un second substrat.

Cette réaction indique la liaison séquentielle des substrats ainsi que la libération séquentielle du produit. Ce type de mécanisme est observé dans les réactions catalysées par les lactates déshydrogénés impliquant le NAD+ et le lactate.

8.7.2. Liaison aléatoire du substrat – Dans ce type, A ou B peuvent se lier en premier à l’enzyme, suivi de l’autre substrat et de la libération du produit.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Mécanisme de ping-pong

L’autre possibilité dans la réaction bi-substrat est qu’un substrat, A, se lie à l’enzyme et, en réagissant avec elle, un produit, P, est libéré et l’enzyme se transforme en une forme modifiée, E ‘. Le deuxième substrat, B, entre et se lie avec l’enzyme modifiée pour donner le deuxième produit, Q et régénérer l’enzyme, E.

Les réactions suivant le mécanisme ci-dessus sont appelées réactions de Ping-Pong ou de double déplacement. Ce type de mécanisme est observé dans les réactions catalysées par les aminotransférases.

Ces enzymes catalysent le transfert d’un groupe amino d’un acide aminé à un acide α-céto.Les produits formés sont un nouvel acide aminé correspondent à l’acide céto et un nouvel acide céto correspondent au squelette carboné de l’acide aminé tel que : –

Un autre exemple de réaction de ping-pong est la phosphoglycérate mutase. L’enzyme obtient du phosphate à partir d’un substrat et après phosphorylation de l’enzyme, le phosphate est transféré sur le deuxième substrat.

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