TEXTE

Les virus vivent des environnements très différents selon qu’ils se répliquent à l’intérieur d’une cellule hôte ou en transit d’un hôte à un autre. Au sein d’une cellule, le virus et ses composants sont exposés à un environnement réducteur, où le potentiel redox est déterminé principalement par le glutathion (18). En revanche, à l’extérieur d’une cellule, le virus est exposé à de l’oxygène et à des produits toxiques dérivés de l’oxygène, tels que le peroxyde d’hydrogène, le superoxyde et le radical hydroxyle, des espèces réactives susceptibles d’inactiver le virus. Pour faire face à de tels composés hautement réactifs, les plantes et les animaux expriment des enzymes capables de les convertir en produits non toxiques. Des exemples de telles enzymes sont la catalase, les peroxydases et la superoxyde dismutase (28). Nous décrivons ici les résultats d’études démontrant la présence de catalase à l’intérieur du virion herpétique simplex purifié. Des tests ont ensuite été effectués pour déterminer si la catalase interne pouvait protéger le virus de l’inactivation par H2O2.

Des études de catalase ont été réalisées avec le virus de l’herpès simplex 1 (HSV-1) qui a été cultivé sur des cellules Vero en culture et purifié par centrifugation par gradient de densité de saccharose. Lorsque les suspensions de virus ont été ajustées à 1% de H2O2, des bulles d’oxygène ont commencé à se former rapidement, indiquant la présence de catalase (Fig. 1a, tube gauche). Les bulles sont apparues visuellement après quelques secondes d’incubation à température ambiante et ont continué à se former et à s’agrandir pendant au moins 20 min. Cependant, aucune bulle ne s’est formée si l’azoture de sodium, inhibiteur de la catalase, était ajouté à la suspension du virus avant le traitement par H2O2 (Fig. 1a, à droite). Les tests étaient également négatifs lorsque (i) le virus a été retiré de la solution par centrifugation avant l’ajout de H2O2 ou (ii) les capsides HSV-1 (capsides B) ont été substituées au virus intact. Dans des essais similaires, des bulles indiquant la présence de catalase n’ont pas été observées avec le virus de la stomatite vésiculaire purifié ou l’adénovirus humain 2 (données non présentées). L’analyse par Western blot a confirmé la présence de catalase associée au virus HSV-1 mais pas à l’adénovirus, au virus de la stomatite vésiculaire (VSV) ou aux capsides HSV-1 A (Fig. 1b).

Identification de la catalase associée au HSV-1 par dosage enzymatique (a), analyse par Western blot (b) et centrifugation par gradient de densité de saccharose (c). Le panneau a montre un tube contenant du HSV-1 purifié 20 min après que la solution a été ajustée à 1% de H2O2 (tube de gauche) et une incubation similaire à laquelle un inhibiteur de catalase (azoture de sodium de 2 mM) a été ajouté avant H2O2 (à droite). Notez la formation de bulles dans le tube gauche, indiquant la présence de catalase dans le virus. La concentration de virus était de 0,25 mg / ml dans le TNE (Tris-HCl 0,01 M, NaCl 0,5 M, EDTA 1 mM, pH 7,5) et l’incubation était à température ambiante. Le virus était la souche KOS de HSV-1, qui a été cultivée sur des cultures monocouches de cellules Vero et purifiée par centrifugation par gradient de densité de saccharose, et le titre a été déterminé par dilution du point final comme décrit précédemment (14). Le panneau b montre les résultats d’un test de Western blot pour la présence de catalase dans le HSV-1, l’adénovirus humain 2 (HAd2), le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et les capsides HSV-1 A. Adénovirus humain 2 et virus de la stomatite vésiculaire (Indiana; Souche San Juan) ont été cultivées sur des cultures monocouches de cellules HeLa et Vero, respectivement, et purifiées par des procédures décrites précédemment (12, 17). Des méthodes publiées ont également été utilisées pour la purification des capsides HSV-1 A et B (23). Les principales protéines de la capside ont été détectées par coloration de la tache avec 1% de Ponceau S (rangée supérieure), tandis que la catalase a été détectée par immunomarquage avec un anticorps spécifique de la catalase (Calbiochem; polyclonal de lapin 219010; dilution 1:5 000) (15). Notez que la catalase a été détectée dans le virus HSV-1 mais pas dans les capsides HAd2, VSV ou HSV-1 A. Le panneau c montre les résultats de l’analyse du gradient de densité du saccharose. Un total de 50 µg de HSV-1 purifié dans 50 µl de TNE a été centrifugé sur un gradient de 600 µl de 20% à 50% de saccharose dans du TNE. La centrifugation a été effectuée pendant 45 min à 22 000 tr/min dans un rotor Beckman SW55 à 4 °C. Le gradient a été fractionné, et les fractions individuelles ont été analysées par SDS-PAGE suivie d’un buvardage sur du polyvinylidène difluorure (PVDF) et d’une coloration avec du Ponceau à 1% S. Le buvard a ensuite été retiré et coloré avec un anticorps spécifique de la catalase (qui a migré de manière coïncidente avec la catalase standard; Worthington LS001872). Notez que la position du virus dans le gradient (rangée du haut) coïncide avec celle de la catalase (rangée du bas), suggérant que les deux sont associés.

Des expériences de contrôle ont été réalisées pour confirmer que la catalase était associée au HSV-1 et non aux impuretés présentes dans la préparation du virus. Le HSV-1 purifié a été centrifugé en une bande sur un gradient de densité de saccharose, le gradient a été fractionné et l’analyse par Western blot a été utilisée pour tester les fractions de gradient individuelles pour la présence de catalase. Les résultats ont montré que la catalase était présente dans les fractions contenant le virus mais pas dans les fractions flanquantes (Fig. 1c). Les résultats sont interprétés comme indiquant que la catalase est associée au HSV-1 et non à des contaminants, tels que des bactéries contenant de la catalase ou des matériaux de cellules hôtes dans la préparation du virus. Comme le génome du HSV-1 ne code pas la catalase (22), l’enzyme associée au virus doit être dérivée de la cellule hôte. Les premières études sur le virus de la vaccine ont démontré la présence de catalase à l’intérieur du virion mature (8). En dehors de cette observation, nous ne connaissons aucun autre rapport de catalase en tant que composant d’une structure virale.

Une analyse plus poussée de la catalase associée au HSV-1 visait à déterminer l’emplacement de l’enzyme dans le virion. Deux types d’expériences ont été faites. Tout d’abord, le virus purifié a été traité avec l’enzyme protéolytique pronase pour dégrader les glycoprotéines virales et toutes les protéines non contenues dans la membrane du virion. On s’attendait à ce que les protéines virales internes ne soient pas affectées, car la pronase ne traverse pas la bicouche lipidique du virus (16). Après le traitement par pronase, le virus a été récolté par centrifugation et l’étendue de la perte de catalase a été déterminée par analyse Western blot. Les résultats n’ont montré aucune preuve de perte de catalase dans deux concentrations de virus testées (voir la bande de catalase à la Fig. 2a, voies 1 et 2). Les contrôles internes ont démontré que les glycoprotéines de surface du virus gB et gH étaient clivées comme prévu (Fig. 2a; comparer les voies 2 et 3). De même, l’analyse par Western blot a démontré que la glycoprotéine D du HSV-1 était digérée par la pronase ou la trypsine dans des conditions où la catalase n’était pas affectée (Fig. 2b). La catalase purifiée en solution a également été digérée dans les mêmes conditions. En revanche, aucune dégradation du tégument interne (UL47, UL48 et UL49) ou des protéines de capside (UL19, UL38, UL18; Fig. 2a, voies 1 et 2) a été observée. Les résultats sont interprétés comme indiquant que la catalase est située à l’intérieur de l’enveloppe HSV-1.

Localisation de la catalase dans le HSV-1 par traitement de virions purifiés par la pronase (voies 1 à 3) et le Triton X-100 (a, voies 4 et 5) et par traitement par la pronase et la trypsine (b, voies 1 à 3). Le panneau a montre une analyse de la PAGE SDS et du Western blot des protéines présentes dans le HSV-1 intact (voies 3 et 4) et dans les virions après traitement par la pronase (voies 1 et 2) et le Triton X-100 (voie 5). Notez que la catalase s’est avérée présente dans les virions intacts (voies 3 et 4) et dans les virions traités à la pronase (voies 1 et 2) mais pas dans les virions après traitement avec 1% de Triton X-100 (voie 5). Le traitement à la pronase a été réalisé par digestion du HSV-1 purifié (0,25 mg/ml) avec 1 mg/ml de pronase (Streptomyces griseus ; Calbiochem 537088) pendant 4 h à 37°C. Après traitement à la pronase, le virus a été réisolé par centrifugation par gradient de densité de saccharose avant analyse SDS-PAGE et Western blot. Le traitement par Triton X-100 a été effectué en ajustant le virus purifié à 1% de Triton X-100 dans un tampon TNE contenant du dithiothréitol (DTT) de 10 mM et en incubant pendant 15 min sur glace (4 ° C). Les capsides résultantes ont ensuite été purifiées par centrifugation par gradient de saccharose avant analyse SDS-PAGE et Western blot. (b) Analyse par Western blot du HSV-1 purifié après traitement in vitro avec de la pronase ou de la trypsine. Un total de 100 µl de HSV-1 purifié (1 mg / ml) a été ajusté à 2 mg / ml de pronase ou 2 mg / ml de trypsine. Une incubation témoin n’avait pas d’enzyme. Les mélanges ont été incubés pendant 2 h à 37°C, et les virions ont été purifiés à l’écart des enzymes par centrifugation sur un gradient de saccharose de 20% à 50% comme décrit dans la légende de la Fig. 1. Les échantillons de virus ont été granulés par centrifugation et examinés par analyse SDS-PAGE et Western blot. Des taches ont été colorées pour la catalase (polyclonal de lapin; voir ci-dessus) et la glycoprotéine D (anticorps monoclonal de souris DL11; un cadeau de Gary Cohen et Roselyn Eisenberg; 1:5 000). Notez que le traitement par protéase a provoqué la digestion de la glycoprotéine D, mais pas de la catalase, indiquant que la catalase est située à l’intérieur de la membrane HSV-1.

Une définition plus précise de la localisation de la catalase a été obtenue par traitement du virus purifié avec le détergent non ionique Triton X-100 (TX-100). Lorsqu’il est effectué avec un virus frais, ce traitement entraîne une perte de la membrane du virus, des glycoprotéines membranaires et de la quasi-totalité des 20 protéines tégument ou plus (toutes sauf UL36, UL37 et US3) (13, 21, 27). La capside conserve cependant son intégrité et aucune des principales protéines de la capside n’est perdue. L’ADN du virus est retenu à l’intérieur de la capside. Les expériences ont impliqué le traitement du HSV-1 avec 1% de TX-100 et l’isolement des capsides résultantes par centrifugation par gradient de densité de saccharose. L’analyse par Western blot a ensuite été utilisée pour tester la présence de catalase dans les capsides. Les résultats ont démontré que les glycoprotéines virales et les protéines tégument étaient éliminées comme prévu et que la catalase était également éliminée (voir Fig. 2a, voies 4 et 5). Cette expérience est interprétée comme indiquant que la catalase est présente dans le tégument HSV-1.

Des informations telles que celles de la Fig. 2 peut être utilisé pour déterminer le nombre de molécules de catalase par virion HSV-1 (15). Cette mesure a été effectuée à partir de deux aliquotes identiques de virus purifié. Les deux ont été utilisés pour déterminer (i) le nombre de molécules principales de protéines de capside (UL19) à partir d’un gel coloré en bleu de Coomassie et (ii) le nombre de molécules de catalase de 60 kDa à partir d’un Western blot calibré. Dans une détermination représentative, cette analyse a donné une valeur de 1: 207,5 pour le rapport molaire de la catalase sur UL19. Comme il y a 955 molécules UL19 par capside HSV-1, le nombre de molécules de catalase par capside a été déterminé à 955/207,5 ou 4,6. Une deuxième détermination similaire a donné une valeur de 7,1 molécules de catalase. Comme il y a quatre sous-unités de 60 kDa dans une molécule de catalase active (11, 20), les résultats indiquent la présence de 1 à 2 tétramères de catalase par virion.

La présence de catalase à l’intérieur du virion HSV-1 suggère la possibilité qu’elle puisse être impliquée dans la protection du virus contre les dommages oxydatifs causés par H2O2. Alternativement, la catalase peut être incorporée passivement dans le HSV-1 lorsque le tégument est ajouté dans le cytoplasme de la cellule hôte et n’avoir aucune fonction protectrice. Pour distinguer les deux possibilités, nous avons examiné la sensibilité du HSV-1 purifié à l’inactivation par H2O2in vitro. Le HSV-1 a été traité par H2O2 en présence ou en l’absence de l’inhibiteur de catalase azoture de sodium (NaN3), et le titre viral a été déterminé par la suite (en l’absence d’inhibiteur de catalase). Les résultats ont montré que si 50 mm d’H2O2 produisaient une diminution modeste du titre (3 à 4 fois), un effet létal de 106 fois ou plus a été observé en présence de NaN3 (tableau 1). Les expériences de contrôle ont montré peu de destruction du HSV-1 par NaN3 seul (tableau 1). Les résultats sont interprétés comme indiquant que la catalase offre un niveau significatif de protection contre l’inactivation du HSV-1 par H2O2.

On ne s’attend pas à ce que le HSV-1 doive être protégé contre les dommages oxydatifs causés par le H2O2 lorsqu’il est associé à une cellule hôte. Comme décrit ci-dessus, un environnement réducteur se trouve à l’intérieur de la cellule, ce qui empêcherait la formation de H2O2. En dehors de la cellule hôte, cependant, l’environnement est oxydant, capable de produire du H2O2 à la fois à l’intérieur du virus et dans le milieu environnant. Le HSV-1 rencontrerait cet environnement lorsqu’il est transmis d’un hôte à un autre, et la catalase pourrait être impliquée dans la protection de l’infectiosité du HSV-1 pendant le transit. La catalase associée au HSV-1 peut également fournir une protection contre le H2O2 produit par des bactéries commensales ou d’autres sources. Il a été démontré, par exemple, que le H2O2 produit par les lactobacilles protège le tractus génital féminin des maladies dues à une infection microbienne (4). En raison de son taux catalytique élevé, la catalase associée au virus pourrait jouer un rôle dans la protection du HSV-1 malgré son faible nombre de copies (1 à 2 copies par virion). La catalase hépatique, par exemple, est capable de détoxifier des dizaines de millions de molécules d’H2O2 par seconde, parmi les taux catalytiques les plus élevés rapportés pour n’importe quelle enzyme (2).

Tous les virus de la famille de l’herpès ont un tégument, une couche de protéine située entre la capside du virus et la membrane (5, 6, 9, 13). Le tégument HSV-1 a une épaisseur de 40 à 50 nm et se compose d’environ 20 espèces de protéines distinctes, qui sont presque toutes codées dans le génome du virus. Les protéines de Tégument diffèrent sensiblement dans leur abondance dans le virion avec 800 copies ou plus des espèces principales, telles que UL47, UL48 et UL49 (voir Fig. 2a, voie 3) (5, 16). De nombreuses protéines tégument sont impliquées dans les premières étapes de la réplication du HSV-1, telles que l’activation de la transcription précoce des gènes et l’atténuation de la synthèse des protéines de la cellule hôte (13, 24, 25). Le tégument est assemblé dans le virion HSV-1 naissant sous forme de bourgeons de capside contenant de l’ADN dans une vésicule du réseau trans-Golgi (10). Il est suggéré que la catalase est incorporée avec d’autres protéines de tégument pendant le processus de bourgeonnement.

Dans les cellules non infectées, la plupart des catalases se trouvent séquestrées dans les peroxysomes (26). Pour qu’elle puisse être incorporée dans la progéniture HSV-1 lors de la tégumentation comme décrit ci-dessus, la catalase devrait être libérée des peroxysomes. Nous suggérons que cela pourrait être une conséquence du réarrangement à grande échelle des membranes cytoplasmiques qui accompagne la réplication du HSV-1 (1).

Palamara et coll. (19) ont démontré qu’une diminution de la concentration de glutathion cytoplasmique survient rapidement après l’infection des cellules Vero par le HSV-1. Une diminution de la concentration de glutathion devrait entraîner une diminution du potentiel de réduction cytosolique, et cette diminution semble potentialiser la réplication du HSV-1. On a constaté que le glutathion supplémentaire fourni dans le milieu de croissance antagonisait la croissance du HSV-1 (19). Comme le glutathion ajouté à l’extérieur, la catalase cytosolique peut augmenter le potentiel réducteur du cytoplasme en éliminant H2O2. Il est donc suggéré que l’une des conséquences de l’incorporation de la catalase dans les virions descendants pourrait être de potentialiser la croissance du virus en privant les cellules infectées de catalase.

Le petit nombre de molécules de catalase par virion peut expliquer pourquoi il n’a pas été détecté dans une analyse spectrométrique de masse de virions HSV-1 entiers (7). Il existe plusieurs protéines de virion HSV-1 à nombre de copies élevé qui pourraient masquer le signal de la catalase (par exemple, il existe des milliers de copies de molécules de glycoprotéines et 955 copies de la protéine principale de la capside). L’abondance de catalase ne répond pas à la norme informelle de détection par spectrométrie de masse (visibilité sur un gel SDS-PAGE coloré à Coomassie). La peroxirédoxine, une protéine peroxysomique à activité antioxydante, a été détectée dans l’analyse spectrométrique de masse du HSV-1 (7, 26).

À l’avenir, il pourrait être possible d’exploiter la sensibilité du HSV-1 aux effets cytotoxiques du H2O2. On s’attend à ce que le virus soit particulièrement vulnérable lorsqu’il se trouve dans un environnement oxydant à l’extérieur de la cellule hôte et lorsque la catalase est inhibée.