I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
Enzimatikus Reakciók: (a képek egy új ablakban)

• Polimerizáció
• Lektorálás
• Primer Eltávolítása

DNS-polimeráz nem vesz részt a DNS-replikáció a prokaryotes. A DNS-lánc növekedése 5′ – 3′ irányban van, a 3′ hidroxil végén hozzáadva. Az új lánc alappárban van a sablonnal, az új lánc és sablon pedig antiparallel. A DNS-polimeráz i a legelterjedtebb polimeráz, amely a DNS replikációja, javítása és rekombinációja során keletkező DNS-rések kitöltésére szolgál.

történelem:

DNS polimeráz I fedezte fel Arthur Kornberg et al. az 1956. Kezdeti eredményeit először az amerikai kísérleti biológiai Társaságok Szövetsége (FASEB) 1956-os éves ülésén mutatták be Atlantic Cityben, New Jersey-ben. A kritikusok a kezdeti papír javasolta, hogy a szerzők utalnak, hogy a termék, mint a ‘polydeoxyribonucleotide’ helyett ‘DNS -‘; A ” DNS ” -t csak a főszerkesztő, John Edsall (Friedberg 2006) fellebbezése után hagyták jóvá. További két tanulmányt 1958-ban adott ki a Lehman et al. és Bessman et al., amely véglegesen megállapította, hogy a DNS-polimeráz DNS-replikációt végez. Kornberg 1959-ben Nobel-díjat kapott a DNS-polimeráz I.

1969-es felfedezéséért, Jovin et al. tisztázta az aminosav összetételét (Jovin et al. 1969a, b). Ugyanebben az évben DeLucia és Cairns izoláltak egy E-T. a DNS-polimerázt befolyásoló mutációval rendelkező coli törzs meglepő módon megállapította, hogy a mutáns normálisan szintetizált DNS. Ez a felfedezés kétségeket vetett fel a DNS-polimeráz replikációban betöltött szerepével kapcsolatban, és arra késztette a csoportokat, hogy más replikációs enzimeket keressenek. Ugyanakkor Klenow és munkatársai kimutatták, hogy a DNS-polimeráz proteolitikus enzim szubtilizinnel (Carlsberg típus) történő kezelése a polimeráz aktivitásának növekedését és az exonukleáz aktivitásának csökkenését eredményezte. Az így létrejövő DNS-polimerázt izolálták és “Klenow-fragmentumnak” nevezték (Klenow and Henningsen 1970a, and Klenow and Overgaard-Hansen 1970).

1970-ben az E. coli DNS-polimeráz II-t izolálták, és Arthur Kornberg fia, Thomas Kornberg (Kornberg és Gefter 1970) jellemezte. A DNS-polimeráz II-ről a Knipperek, valamint Mózes és Richardson is önállóan számoltak be 1970-ben (Mózes és Richardson 1970b). Egy évvel később Thomas Kornberg és Gefter azonosította a DNS-polimeráz III-at (Kornberg és Gefter 1971).

a DNS polimeráz I-vel végzett legutóbbi munka magában foglalta a szubsztrát specificitás molekuláris alapjának vizsgálatát termodinamikai vizsgálatok révén (Wowor et al. 2010) és egymolekula FRET kísérletek (Santoso et al. 2010). Hastings et al. megvizsgálták az öt E. coli DNS-polimeráz kölcsönhatását a sejtes stressz során (Hastings et al. 2010), és Kukreti et al.a vizsgálatok célja annak meghatározása, hogy mely szermaradékok fontosak a 3′-5′ exonukleáz aktivitás szempontjából (Kukreti et al. 2008).

specificitás:

A DNS-szintézishez olyan primer szálra van szükség, amelynek szabad 3 ‘ – hidroxil-terminálja egy DNS-sablonszálhoz van hegesztve, és a dezoxinukleotid-trifoszfátok bázispárokat alkotnak a sablonnal. A pirofoszfát felszabadulásával az adagolás 5′ – 3’ irányban van. Az enzim aktív DNAs tartalmazó egyetlen szálú rések, valamint a DNAs egyszálú szünetek vagy nicks. Bizonyos körülmények között az RNS-DNS hibridek és az RNS-duplex sablonindítóként szolgálhatnak (Setlow 1972).

a DNS-polimeráz I-hez kapcsolódó 5′ – 3 ‘exonukleáz aktivitás mind az egy -, mind a kettős szálú DNS-t 5′ – 3′ irányban lebontja, így 5′-mononukleotidokat eredményez. Az 5′-3’exonukleáz aktivitás a kettős szálú DNS-re jellemző, ami 5’ – mononukleotidokat és oligonukleotidokat eredményez. A DNS-polimeráz i a nem megfelelő régiókat is kivághatja a DNS-ben (Setlow 1972).

a DNS-polimerázok hasonló szerkezete azt mutatta, hogy a legtöbb DNS-polimeráz enzim azonos két fém-ion-katalizált polimeráz mechanizmust használ. Egy fémion aktiválja az alapozó 3 ‘ – OH-ját a dNTP a-foszfát elleni támadáshoz. A másik fémion stabilizálja a kilépő oxigén negatív töltését, és kelátot képez a b – és g-foszfátokkal (Steitz 1999).

a Klenow fragmentum az E. coli DNS-polimeráz I proteolitikus terméke, amely megtartja a polimerizációt és 3′ – 5 ‘exonukleáz aktivitást, de 5′ – 3’ exonukleáz aktivitást veszített.

összetétel:

A DNS polimeráz i az E. coliban található domináns polimerizáló enzim. Egyetlen diszulfidkötést és egy szulfhidrilcsoportot (Jovin et al. 1969b). Az E. coli-ból öt különálló DNS-polimerázt izoláltak, amelyeket I, II, III, IV és V. DNS polimeráz I-nek neveztek ki, hogy kitöltsék a DNS replikáció, javítás és rekombináció során felmerülő DNS-réseket. A DNS polimeráz II elsősorban a lemaradó szálban (Kim et al. 1997, Wagner és Nohmi 2000). A DNS-polimeráz III a fő replikatív enzim. A DNS-polimeráz IV és V nagy aktív helyekkel rendelkezik, amelyek lehetővé teszik a több bázist, és ezért hibára hajlamosabbak. Szintén hiányzik a lektorálás-exonukleáz alegységek a téves jelentések kijavításához (Nohmi 2006, and Hastings et al. 2010). Az V DNS-polimeráz csak az SOS által indukált sejtekben van jelen jelentős mennyiségben, a túlzott expresszió pedig korlátozza a DNS-szintézist (Marsh and Walker 1985).

az összes ismert szerkezetű polimeráz doménformáját “jobbkezesnek”, “tenyérnek” és “ujjnak” (Kohlstaedt et al. 1992). Úgy gondolják, hogy a tenyérrégió katalizálja a foszforil-transzfert, és úgy gondolják, hogy az ujjrégió kölcsönhatásba lép a bejövő nukleozid-trifoszfáttal és a sablon bázissal, amelyhez párosul. Úgy gondolják, hogy a hüvelykujj segít a DNS pozicionálásában és a transzlokációban (Brautigam and Steitz 1998).

molekuláris jellemzők:

a DNS polimeráz i-t (polA) kódoló gén körülbelül 3000 bázispárt tartalmaz, és körülbelül 1000 aminosavmaradékot kódol egy egyszerű polipeptidláncban. Még az egymilliárd éves evolúcióval elválasztott organizmusok is (mint például a Deinococcus-Thermus nemzetségek és az E. coli) körülbelül 35% – os aminosav-identitással és körülbelül 50% – os homológiával (Patel et al. 2001).

Protein csatlakozási szám: P00582

Molekulatömeg:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Klenow fragmentum: 70 kDa (gel filtration, klenow and Overgaard-Hansen 1970)

optimális pH:

• a maximális aktivitás pH 7,4-en érhető el kálium-foszfát pufferrel natív DNS vagy poly dAT sablon-alapozó rendszerekhez (Richardson et al. 1964)
• Klenow fragmentum: a maximális aktivitást 7,4-nél kapjuk foszfátpufferrel és 8-nál.4 Tris-HCl puffer

Izoelektromos Pont:

• 5.40 (Elméleti)

Kioltási tényező:

Aktivátorok:

• A kétvegyértékű kation szükséges tevékenység
• Mg2+ koncentráció mellett a 7 mM-es hozamok optimális tevékenység feltételei szerint a standard vizsgálat (Richardson et al. 1964)
• Mn2+ részben teljesítheti a fémion követelményt
• az enzimaktivitást az olyan monovalens kationok koncentrációja is befolyásolja, mint a K+, Rb+, Cs + és NH4 +

inhibitorok:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• nagy százalékos radioaktivitás beépítése nick fordítási vizsgálatokhoz
• Standard referenciaanyag DNS polimerázok vizsgálatához
• váltakozó kopolimerek, például Poly d(A-T) és homopolimerek, például poly DG-poly dC
• Klenow fragment: DNS szekvenálás (Sanger et al. 1977), kitöltése 5 “túlnyúlások és eltávolítása 3” túlnyúlások alkotnak tompa végek (Sambrook 1989), és a második szál szintézis mutagenesis (Gubler 1987)