Taq polimeráz az egyik legelterjedtebb enzim a molekuláris biológiában. 19651-es felfedezése óta a Taq a PCR és a technológia által lehetővé tett downstream alkalmazások gerincévé vált. Ez az erős polimeráz az alapértelmezett választás a legtöbb amplifikációs és klónozási eljárások, valamint a diagnosztikai vizsgálatok, marker gén DNS szekvenálás, és még sok más.

mi teszi a Taq polimerázt olyan különlegessé? A mai cikkben megnézzük a Taq előnyeit és hátrányait, hogy mire van szüksége a Taq polimeráz legjobb PCR-eredményeinek eléréséhez, valamint néhány Taq-származékot, amelyek segítenek jobb eredmények elérésében speciális alkalmazásokhoz.

miért olyan széles körben használják a Taq-t a PCR-hez?

Taq népszerűsége abból fakad, hogy ez volt az első magas hőmérsékletű polimeráz, amelyet molekuláris biológusok fedeztek fel. De ez messze nem az egyetlen oka annak, hogy ma még ilyen nagy a kereslet.

a Taq polimeráz fontos jellemzője, hogy 95°C-ig stabil2. Ez kritikus, mert ez a hőmérséklet, amelyen a DNS denaturálódik-ez a szükséges lépés a PCR reakció elején. Míg bármely mérsékelt hőmérsékletű polimeráz ezen a hőmérsékleten is denaturálna, használhatatlanná téve, a Taq továbbra is tökéletesen készen áll a cél DNS-minta polimerizálására.

Ezen felül a Taq előnye, hogy a 70-80°C-os hőmérsékleti tartományban a legaktívabb2. Ez elég meleg ahhoz, hogy a DNS nem fog újraindulni, de az alacsonyabb hőmérsékleten lágyított primerek sem fognak lehámozni. Tehát a Taq polimeráz rendkívül jól működik azon a hőmérsékleten, amelyet a legtöbb szabványos PCR reakció igényel.

végül a Taq rendkívül jól illeszkedik az alapvető molekuláris biológia igényeihez. A polimeráz elhagyja az a-farkú termékeket, amelyek könnyen klónozhatók vektorba egy szabványos TA klónozó készlet segítségével. A Taq viszonylag rugalmas a GC-tartalom széles skálájával rendelkező DNS-szekvenciákkal szemben, és nem annyira válogatós a cél DNS-vagy dNTP-koncentrációk tekintetében.

mit kell a Taq-nak hatékonyan Polimerizálnia?

ha önmagában egyszerűen hozzáadta a Taq polimerázt egy DNS-mintához,nem sok történne. Ennek oka az, hogy a legtöbb enzimhez hasonlóan a Taq-nak speciális reagenskeverékre van szüksége a megfelelő működéshez.

Az alapvető Taq puffer kálium-kloridot, trisz-hidrokloridot és Triton X-100-at tartalmaz. Ezek a vegyi anyagok kevésbé relevánsak a PCR-reakciók optimalizálása szempontjából, mint a Taq biztonságos tárolása a fagyasztóban történő tárolás során-ami önmagában is fontos a lehető legtöbbet hozza ki a PCR-kből. Miközben saját puffert készíthet a liofilizált Taq enzim rehidrálásához és tárolásához, a polimeráz túlnyomó többségét mesterkeverékként értékesítik a szükséges pufferoldatban már felfüggesztett Taq-val.

a PCR-reakciók szempontjából kritikusabb a magnézium-klorid. A magnézium nélkülözhetetlen kofaktor a Taq polimerázhoz3. Enélkül a Taq nem lesz képes katalizálni a nukleotidok hozzáadását az alapozóhoz vagy a növekvő DNS-szálhoz. A magnézium koncentrációja szintén fontos. Mivel több magnéziumot adnak a PCR-reakcióhoz, a Taq aktívabbá válik, de kevésbé specifikus is csak a cél DNS-szál polimerizálásában.

a magnézium koncentrációfüggő szerepe miatt megtalálható a Taq master keverékek a már tartalmazott magnéziummal, valamint olyan keverékek, amelyek kihagyják. Az utóbbi esetben külön kell hozzáadni a magnézium-kloridot (ami további pipettázási lépést igényel a PCR-k elkészítésekor). Ennek az az előnye, hogy lehet szabályozni a pontos koncentrációja magnézium, így kísérletezni, hogy megtalálják a legoptimálisabb keveréke Taq termelékenység és specificitás.

milyen problémák vannak a Taq polimerázzal?

a Taq-t széles körben használják a rutin PCR-khez, de sajnos nem tökéletes minden alkalmazáshoz. A Taq legjelentősebb hátránya, hogy nem a legpontosabb polimeráz. A Taq hibaaránya körülbelül egy hiba / 100,000 bázispár4. Összehasonlításképpen, a PFU lektoráló polimeráz körülbelül 10-szer pontosabb. Ha PCR-t használ a klónozás vagy a DNS-szekvenálás előtt, ez a hibaarány-különbség nagyon jelentős lehet.

a standard Taq polimeráz problémái lehetnek a cél DNS-szekvenciák körülbelül 1 kB-nál hosszabb erősítésével is. Más típusú polimerázokhoz képest a Taq alacsony processivitással rendelkezik, ami azt jelenti, hogy hatékonysága jelentősen csökken az amplicon hosszával. Ezt az alacsony processivitást súlyosbíthatja a PCR-gátlók jelenléte, amelyek gyakoriak, ha szövetekből, növényekből vagy talajból kivont DNS-vel dolgozik.

végül, míg a Taq polimeráz a leghatékonyabb 70°C feletti hőmérsékleten, az enzim továbbra is 50°C alatti hőmérsékleten működik. ez problematikus, mivel a Taq véletlenül polimerizálhatja az alapozókat vagy a nem célzott DNS-szekvenciákat, amikor a PCR-reakció hőmérséklete csökken, hogy a primerek lágyuljanak a célsorozathoz. Ennek eredményeként a Taq-ról ismert, hogy primer dimereket és más nem kívánt termékeket állít elő, amelyek akadályozhatják a downstream alkalmazásokat, például a klónozást.

speciális Taq polimerázok fejlett alkalmazásokhoz

szerencsére a Taq polimeráz speciális formái megoldják ezeket a problémákat. Például a HighQ ALLin Taq polimeráz a Taq szintetikus változata, amely több processivitással rendelkezik, mint a standard Taq. Ennek eredményeként könnyebben elérheti az amplicon hozamokat a magas GC sablonokból, az 1 kB-nál hosszabb sablonokból, valamint a mérsékelt inhibitorkoncentrációjú mintákból.

a Taq egy másik gyakori formája, mint például az ALLin Hot Start Taq, molekuláris inhibitorral van kialakítva, hogy alacsonyabb hőmérsékleten inaktívvá váljon. A Hot start Taq csak 95°C-ra történő melegítés után működik, ami jelentősen csökkenti a primer dimerek és a nem specifikus ampliconok képződését a polimerizáció következtében a PCR-reakciók megkezdése előtt. Ennek eredményeként magasabb hozamot érhet el, ha hosszabb célsorozatokkal dolgozik, majd levágja a háttérerősítőket, amelyek általában tisztítást igényelnek.

következtetés

a Taq polimeráz már régóta a választott enzim mind a rutin, mind a komplex PCR alkalmazásokhoz. Tökéletesen illeszkedik a PCR reakció követelményeihez, miközben egyszerűvé teszi az olyan downstream alkalmazásokat, mint a klónozás vagy a szekvenálás. Bár a standard Taq-nak vannak hátrányai, ezeket nagyrészt egy tervezett vagy melegindító Taq polimeráz segítségével oldják meg. Az alkalmazások túlnyomó többségében a Taq polimeráz továbbra is a molekuláris biológusok számára a go-to enzim.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Határok a mikrobiológiában 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnosztikai molekuláris patológia: útmutató az alkalmazott molekuláris teszteléshez.

3. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molekuláris Biológia Nemzetközi 287430.