I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
Reazioni Enzimatiche: (le immagini si apre in una nuova finestra)

• Polimerizzazione
• Revisione
• Primer Rimozione

DNA polimerasi I partecipa alla replicazione del DNA dei procarioti. La crescita della catena del DNA è nella direzione da 5’ a 3’ con aggiunta all’estremità 3 ‘ idrossile. La nuova catena è abbinata alla base con il modello e la nuova catena e il modello sono antiparalleli. La DNA polimerasi I è la polimerasi più abbondante e funziona per colmare le lacune nel DNA che si presentano durante la replicazione, la riparazione e la ricombinazione del DNA.

Storia:

DNA polimerasi I è stato scoperto da Arthur Kornberg et al. nel 1956. I suoi primi risultati furono presentati per la prima volta alla riunione annuale del 1956 della Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) ad Atlantic City, New Jersey. I revisori del suo articolo iniziale hanno suggerito che gli autori si riferiscono al prodotto come “polideossiribonucleotide” piuttosto che “DNA”; ‘DNA’ è stato approvato solo dopo un appello al redattore capo, John Edsall (Friedberg 2006). Altri due documenti sono stati pubblicati nel 1958 da Lehman et al. e Bessman et al., che ha stabilito definitivamente la DNA polimerasi stava eseguendo la replicazione del DNA. Kornberg ha ricevuto il premio Nobel nel 1959 per la sua scoperta della DNA polimerasi I.

Nel 1969, Jovin et al. chiarito la composizione aminoacidica (Jovin et al. 1969 bis, b). Quello stesso anno, DeLucia e Cairns isolato un E. coli ceppo con una mutazione che ha colpito la DNA polimerasi e sorprendentemente trovato che il mutante sintetizzato DNA normalmente. Questa scoperta ha gettato dubbi sul ruolo della DNA polimerasi nella replicazione e ha portato i gruppi a cercare altri enzimi di replicazione. Allo stesso tempo, Klenow e colleghi hanno dimostrato che il trattamento della DNA polimerasi con l’enzima proteolitico subtilisina (tipo Carlsberg) ha comportato un aumento dell’attività della polimerasi e una diminuzione dell’attività dell’esonucleasi. La DNA polimerasi risultante fu isolata e fu chiamata “frammento di Klenow” (Klenow e Henningsen 1970a e Klenow e Overgaard-Hansen 1970).

Nel 1970, la DNA polimerasi II di E. coli fu isolata e caratterizzata dal figlio di Arthur Kornberg, Thomas Kornberg (Kornberg e Gefter 1970). La DNA polimerasi II è stata anche riportata in modo indipendente da Knippers e da Moses e Richardson nel 1970 (Moses and Richardson 1970b). Un anno dopo, Thomas Kornberg e Gefter identificarono la DNA polimerasi III (Kornberg e Gefter 1971).

Il recente lavoro con la DNA polimerasi I ha incluso lo studio delle basi molecolari della specificità del substrato attraverso studi termodinamici (Wowor et al. 2010) e esperimenti di FRET a singola molecola (Santoso et al. 2010). Hastings et al. hanno studiato le interazioni delle cinque DNA polimerasi di E. coli durante lo stress cellulare (Hastings et al. 2010), e Kukreti et al.gli studi hanno lo scopo di determinare quali residui sono importanti per l’attività esonucleasica 3’-5 ‘ (Kukreti et al. 2008).

Specificità:

La sintesi del DNA richiede un filo di primer con un terminale libero di 3 ‘ – idrossile ricotto in un filo di DNA e i trifosfati deossinucleotidi formano coppie di basi con il modello. L’aggiunta è nella direzione da 5’ a 3’ con rilascio di pirofosfato. L’enzima è attivo con DNAs che contengono le singole lacune incagliate ed anche con DNAs con le rotture o le scalfitture del singolo filamento. In alcune condizioni, gli ibridi RNA-DNA e un duplex RNA possono servire come template-primer (Setlow 1972).

L’attività dell’esonucleasi da 5’ a 3’ associata alla DNA polimerasi I degrada il DNA a singolo e doppio filamento nella direzione da 5’ a 3’, producendo 5’-mononucleotidi. L’attività dell’esonucleasi da 5 ‘a 3’è specifica per il DNA a doppio filamento, producendo 5’ -mononucleotidi e oligonucleotidi. La DNA polimerasi I può anche asportare regioni non corrispondenti nel DNA (Setlow 1972).

La struttura simile delle DNA polimerasi ha indicato che la maggior parte degli enzimi della DNA polimerasi utilizza un meccanismo di polimerasi catalizzata da due ioni metallici identici. Uno metal metallico attiva il primer 3 ‘ – OH per l’attacco all’a-fosfato del dNTP. L’altro ion metallico stabilizza la carica negativa dell’ossigeno in uscita e chela i fosfati b e g (Steitz 1999).

Il frammento di Klenow è un prodotto proteolitico della DNA polimerasi I di E. coli che mantiene la polimerizzazione e l’attività dell’esonucleasi da 3’ a 5’, ma ha perso l’attività dell’esonucleasi da 5’ a 3’.

Composizione:

La DNA polimerasi I è l’enzima polimerizzante predominante trovato in E. coli. Contiene un singolo legame disolfuro e un gruppo sulfidrilico (Jovin et al. 1969b). Cinque distinte DNA polimerasi sono state isolate da E. coli e sono state designate funzioni I, II, III, IV e V. DNA polimerasi I per colmare le lacune del DNA che si presentano durante la replicazione, la riparazione e la ricombinazione del DNA. La DNA polimerasi II funziona anche nell’editing e nella correzione di bozze principalmente nel filamento in ritardo (Kim et al. 1997, Wagner e Nohmi 2000). La DNA polimerasi III è il principale enzima replicativo. La DNA polimerasi IV e V hanno grandi siti attivi che consentono una maggiore misincorporazione della base e sono quindi più soggetti a errori. Mancano anche le subunità di correzione delle bozze-esonucleasi per correggere le misincorporazioni (Nohmi 2006 e Hastings et al. 2010). La DNA polimerasi V è presente a livelli significativi solo nelle cellule indotte da SOS e la sovraespressione limita la sintesi del DNA (Marsh e Walker 1985).

La forma del dominio di tutte le polimerasi le cui strutture sono note è stata descritta come una “mano destra” con domini “pollice”, “palmo” e “dito” (Kohlstaedt et al. 1992). Si pensa che la regione del palmo catalizzi il trasferimento di fosforile e che la regione del dito interagisca con il trifosfato nucleosidico in arrivo e la base del modello a cui è accoppiato. Si ritiene che il pollice aiuti nel posizionamento del DNA e nella traslocazione (Brautigam e Steitz 1998).

Caratteristiche molecolari:

Il gene che codifica la DNA polimerasi I (polA) contiene circa 3.000 coppie di basi e codifica circa 1.000 residui di amminoacidi in una semplice catena polipeptidica. Anche organismi separati da un miliardo di anni di evoluzione (come Deinococcus-Thermus generi e E. coli) hanno circa il 35% di identità aminoacidica e circa il 50% di omologia (Patel et al. 2001).

Numero di adesione della proteina: P00582

Peso molecolare:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Frammento di Klenow: 70 kDa (gel filtration, Klenow and Overgaard-Hansen 1970)

Ph ottimale:

• L’attività massima si ottiene a pH 7.4 con tampone fosfato di potassio per sistemi di template-primer nativi DNA o poly dAT (Richardson et al. 1964)
• Frammento di Klenow: le attività massime si ottengono a 7,4 con tampone fosfato e a 8.4 con Tris-HCl buffer

Punto Isoelettrico:

• 5.40 (Teorico)

Coefficiente di Estinzione:

Attivatori:

• Un cationi bivalenti è necessaria per l’attività di
• Mg2+, a una concentrazione di 7 mM, risulta ottimale attività in condizioni di test standard (Richardson et al. 1964)
• Mn2 + può parzialmente soddisfare il requisito di ioni metallici
• L’attività enzimatica è anche influenzata dalle concentrazioni di cationi monovalenti come K+, Rb+, Cs+ e NH4+

Inibitori:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Incorporazione ad alta percentuale di radioattività per i saggi di traduzione nick
• Materiale di riferimento standard per lo studio delle DNA polimerasi
• Produzione di copolimeri alternati come poly d(A-T) e omopolimeri come poly dG-poly dC
• Klenow fragment: DNA sequencing (Sanger et al. 1977), riempimento di 5 ‘strapiombi e rimozione di 3’ strapiombi per formare estremità smussate (Sambrook 1989), e secondo strand synthesis in mutagenesis (Gubler 1987)