Descrizione del test

Esoni codificanti MLH1 1-19, esoni codificanti MSH2 1-16, esoni codificanti MSH6 1-10 e esoni codificanti PMS2 1-15, e anche nelle estremità 5 ‘e 3’ di tutti gli introni e le regioni non tradotte vengono analizzati mediante sequenziamento. L’analisi di cancellazione/duplicazione grossolana determina il numero di copia del gene per tutti gli esoni codificanti di MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 e l’esone codificante 9 di EPCAM. L’inversione degli esoni codificanti 1-7 del gene MSH2 viene rilevata da NGS e confermata mediante PCR e elettroforesi su gel di agarosio. Sono sempre riportati risultati intronici clinicamente significativi oltre 5 coppie di basi. Varianti introniche di significato clinico sconosciuto o improbabile non sono riportate oltre 5 coppie di basi dalla giunzione di giunzione. L’acido deossiribonucleico genomico (gDNA) è isolato dal campione del paziente usando la metodologia standardizzata e quantificato. L’arricchimento di sequenza degli esoni codificanti mirati e dei nucleotidi intronici adiacenti viene effettuato con una metodologia di cattura dell’esca, utilizzando sonde oligonucleotidiche biotinilate lunghe seguite da reazione a catena della polimerasi (PCR) e sequenziamento di prossima generazione (NGS). Sanger sequenziamento viene eseguito per tutte le regioni mancanti o con copertura di profondità di lettura insufficiente per il rilevamento variante eterozigote affidabile. Varianti potenzialmente omozigoti, varianti in regioni complicate da interferenze pseudogene e chiamate varianti che non soddisfano la profondità di copertura e le soglie di qualità della frequenza dell’allele variante sono verificate dal sequenziamento Sanger. Viene eseguita anche l’analisi di cancellazione/duplicazione grossolana di MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2 utilizzando la profondità di lettura dai dati NGS e EPCAM utilizzando l’amplificazione della sonda dipendente dalla legatura multiplex (MLPA). Qualsiasi modifica del numero di copie rilevata da NGS è confermata da microarray cromosomico mirato e / o MLPA. Se viene rilevata una delezione negli esoni 13, 14 o 15 di PMS2, verrà eseguito un sequenziamento a doppio filamento degli esoni appropriati dello pseudogene, PMS2CL, per determinare se la delezione si trova nel gene PMS2 o nello pseudogene. Se viene rilevata una cancellazione nell’esone 9 di EPCAM, verrà eseguita l’analisi di cancellazione / duplicazione degli esoni 3 e 8 di EPCAM. Per l’EPCAM, vengono riportate solo eliminazioni grossolane che comprendono l’estremità 3’ del gene.