Taq polimerasi è uno degli enzimi più onnipresenti in biologia molecolare. Dalla sua scoperta nel 19651, Taq è diventato la spina dorsale della PCR e di tutte le applicazioni a valle che la tecnologia consente. Questa potente polimerasi è la scelta predefinita per la maggior parte delle procedure di amplificazione e clonazione, nonché test diagnostici, sequenziamento del DNA del gene marcatore e molto altro.

Cosa rende la Taq polimerasi così speciale? Nell’articolo di oggi, daremo un’occhiata ai vantaggi e agli svantaggi di Taq, ciò di cui hai bisogno per ottenere i migliori risultati di PCR dalla polimerasi Taq e alcuni derivati Taq che possono aiutarti a ottenere risultati migliori per applicazioni specializzate.

Perché Taq è così ampiamente usato per PCR?

La popolarità di Taq beneficia del fatto che è stata la prima polimerasi ad alta temperatura scoperta dai biologi molecolari. Ma questo è tutt’altro che l’unico motivo per cui è ancora così richiesto oggi.

La Taq polimerasi ha l’importante caratteristica di essere stabile a temperature fino a 95°C2. Questo è fondamentale perché questa è la temperatura alla quale il DNA denatura-un passo richiesto all’inizio della reazione PCR. Mentre qualsiasi polimerasi a temperatura moderata denaturerebbe anche a quella temperatura, rendendola inutile, Taq rimane perfettamente pronto per iniziare a polimerizzare il campione di DNA bersaglio.

Inoltre, Taq ha il vantaggio di essere più attivo nella gamma di temperature 70-80°C2. È abbastanza caldo che il DNA non si riannealerà, ma i primer che si sono ricotti a temperature più basse non si stacceranno. Quindi, la polimerasi Taq funziona molto bene alle temperature richieste dalla maggior parte delle reazioni PCR standard.

Infine, Taq soddisfa le esigenze di biologia molecolare di base estremamente bene. La polimerasi lascia prodotti a coda, che possono essere facilmente clonati in un vettore utilizzando un kit di clonazione TA standard. Taq è anche relativamente resistente alle sequenze di DNA con una vasta gamma di contenuti GC e non è poi così schizzinosi sulle concentrazioni di DNA bersaglio o dNTP.

Di cosa ha bisogno Taq per polimerizzare in modo efficace?

Se hai semplicemente aggiunto la Taq polimerasi da sola a un campione di DNA, non succederebbe molto. Questo perché, come la maggior parte degli enzimi, Taq ha bisogno di un mix specializzato di reagenti per funzionare correttamente.

Il tampone Taq di base include cloruro di potassio, Tris cloridrato e Triton X-100. Queste sostanze chimiche sono meno rilevanti per ottimizzare le vostre reazioni PCR che per mantenere Taq sicuro durante lo stoccaggio nel congelatore-che di per sé è importante per ottenere il massimo dalle vostre PCR. Mentre è possibile creare il proprio buffer per reidratare e conservare l’enzima Taq liofilizzato, la stragrande maggioranza della polimerasi viene venduta come master mix con Taq già sospeso nella soluzione tampone richiesta.

Più critico per le reazioni della PCR è il cloruro di magnesio. Il magnesio è un cofattore essenziale per la polimerasi Taq3. Senza di esso, Taq non sarà in grado di catalizzare l’aggiunta di nucleotidi al primer o al filamento di DNA in crescita. Anche la concentrazione di magnesio è importante. Come più magnesio viene aggiunto ad una reazione PCR, Taq diventa più attivo, ma anche meno specifico nel polimerizzare solo il filamento di DNA bersaglio.

A causa del ruolo dipendente dalla concentrazione del magnesio, è possibile trovare miscele Taq master con magnesio già incluso e miscele che lo lasciano fuori. In quest’ultimo caso, è necessario aggiungere cloruro di magnesio separatamente (che richiede un ulteriore passaggio di pipettaggio quando si preparano le PCR). Il vantaggio è che è possibile controllare l’esatta concentrazione di magnesio, in modo da poter sperimentare per trovare la miscela più ottimale di produttività e specificità Taq.

Quali sono i problemi con la Taq polimerasi?

Taq è ampiamente utilizzato per PCR di routine, ma sfortunatamente non è perfetto per tutte le applicazioni. Lo svantaggio più notevole di Taq è che non è la polimerasi più accurata là fuori. Taq ha un tasso di errore di circa un errore per 100.000 coppie base4. In confronto, la polimerasi di correzione di bozze Pfu è circa 10 volte più accurata. Se si utilizza la PCR a monte della clonazione o del sequenziamento del DNA, tale differenza nel tasso di errore può essere molto significativa.

La Taq polimerasi standard può anche avere problemi con l’amplificazione di sequenze di DNA bersaglio più lunghe di circa 1 kB. Rispetto ad altri tipi di polimerasi, Taq ha una bassa processività, il che significa che la sua efficienza diminuisce significativamente con la lunghezza del tuo amplicone. Questa bassa processività può essere aggravata dalla presenza di inibitori della PCR, che sono comuni se si lavora con DNA estratto da tessuti, piante o suolo.

Infine, mentre la Taq polimerasi è più efficiente a temperature superiori a 70 ° C, l’enzima continua a lavorare a temperature inferiori a 50°C. Questo è problematico perché Taq può involontariamente polimerizzare primer o sequenze di DNA non bersaglio quando la temperatura nella reazione PCR scende per consentire ai primer di ricottura alla sequenza target. Di conseguenza, Taq è noto per produrre dimeri di primer e altri prodotti indesiderati che possono ostacolare le applicazioni a valle come la clonazione.

Polimerasi Taq specializzate per applicazioni avanzate

Fortunatamente, ci sono forme specializzate di polimerasi Taq che risolvono alcuni di questi problemi. Ad esempio, Highqu Allin Taq polimerasi è una versione sintetica di Taq che ha più processività di Taq standard. Di conseguenza, è possibile ottenere più facilmente rese di amplicone da modelli ad alto GC, modelli di lunghezza superiore a 1 kB e campioni con concentrazioni moderate di inibitori.

Un’altra forma comune di Taq, come l’Allin Hot Start Taq, è progettata con un inibitore molecolare per renderlo inattivo a temperature più basse. Hot start Taq è funzionale solo dopo il riscaldamento a 95°C. Ciò riduce drasticamente la formazione di dimeri di primer e ampliconi aspecifici come risultato della polimerizzazione prima dell’inizio delle reazioni di PCR. Di conseguenza, è possibile ottenere rendimenti più elevati quando si lavora con sequenze di destinazione più lunghe e ridurre gli ampliconi di sfondo che normalmente richiedono la pulizia.

Conclusione

La Taq polimerasi è stata a lungo l’enzima di scelta per applicazioni di PCR sia di routine che complesse. Si adatta perfettamente ai requisiti della reazione PCR, rendendo semplici applicazioni a valle come la clonazione e il sequenziamento. Sebbene il Taq standard abbia alcuni inconvenienti, questi sono in gran parte risolti utilizzando una polimerasi Taq ingegnerizzata o hot start. Per la stragrande maggioranza delle applicazioni, Taq polimerasi rimane il go-to enzima per i biologi molecolari.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Frontiere in Microbiologia 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Patologia molecolare diagnostica: una guida ai test molecolari applicati.

3 Williams M. 2018. Per ulteriori informazioni, consultare il sito . 2014. Biologia Molecolare Internazionale 287430.