椎間板変性は、複雑な多因子病因を伴う一般的な状態です。 1低悪性度の伝染は血清学および文化を使用してディスクherniationおよび坐骨神経痛の患者の84%で識別されるPropionibacteriumのアクネとのディスク退化の原因として提 2分子変化は、異化酵素（カテプシン、リゾチームおよびいくつかのマトリックスメタロプロテイナーゼ）および炎症性サイトカインの産生の増加なども観察されている。 腰椎椎間板ヘルニアを有する3人の若い患者は、手術前に高感度C反応性タンパク質（hs-CRP）の血清濃度が上昇していたとき、手術後の回復が悪いことを示 しかし、高レベルのCRPおよび炎症性サイトカインが局所感染または椎間板ヘルニアに対する炎症反応を示すかどうかは明らかではない。 4

パルボウイルスB19またはエプスタインバーウイルス（EBV）などの病原体は、様々な形態の関節炎の病因において重要な役割を果たす。 5,6ヘルペスウイルスは、生涯の潜伏感染を確立することができ、そのすべてが大規模なDNAウイルスの多様なファミリーです。 これらのウイルスの多くの一次感染は、小児期に一般的です。 7,8

この研究は、椎間板変性の病因におけるヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型（HSV-1）、単純ヘルペスウイルス2型（HSV-2）およびサイトメガロウイルス（CMV）の潜在的な役割を調査することを目的とした。 椎間板切除中に得られた椎間板標本の分子分析は、ウイルス感染がこの疾患の病因に重要な要因である可能性があることを示唆し、変性椎間板にCMVとHSV-1DNAのかなりの頻度を示した。

患者と方法

腰椎椎間板ヘルニアの半年以内に椎間板切除術を受けた16人の連続した患者の合計を研究した。 男性は8人、女性は8人で、平均年齢は40.38歳（17歳から65歳）である。 この研究には倫理的承認がありました。 身体検査とＭＲＩにより腰椎椎間板ヘルニアと診断した。 対照群を提供するために，手術中の胸腰破裂骨折を有する二人の患者から経皮的に椎間板サンプルを得た。 これらの患者はまた、付随する変性を排除するために手術前にMRI検査を受けた。 この研究でテストされたサンプルの性質は、倫理的な理由のために健康な個人からより多くの椎間板を含めることを許可しなかったが、対照として死体標本の代替は、成人集団の大部分が腰痛および椎間板変性の病歴を有するために放棄された。

椎間板切除中に得られた椎間板ヘルニアからの材料に加えて、各患者から末梢血サンプルを採取した。 組織試料を滅菌ポリプロピレン１に入れた。ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出およびポリメラーゼ連鎖反応／定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ／ｑＲＴ−ＰＣＲ）が実施されるまで、５ｍｌのチューブを−８ ０℃で保存した。 血漿からのＨＳＶ−１およびＣＭＶ、Ｉｇｍ＋およびＩｇｇ＋抗体の検出を、標準的な酵素免疫測定法を用いて行った。

DNA/RNA抽出。ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｘ Ｓ ｋｉｔおよびＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ Ｘ Ｓ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ｇｍｂｈ ａｎｄ Ｃ Ｏ．、Düren、ドイツ）、それぞれ、製造業者の指示に従ってください。 精製されたＲＮＡは、ＤＮＡ汚染を回避するためにＤｎａｓｅｉでさらに処理された。 ＰＣＲ増幅またはｑＲＴ−ＰＣＲの前に、分光光度計（２ ６ ０ｎｍ）を使用してＤＮＡおよびＲＮＡ試料の濃度を決定した。

ヘルペスウイルスDNAの検出。8種類のヘルペスウイルス（HSV-1/-2、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）、EBV、CMV、ヒトヘルペスウイルス6、7および8（HHV6、HHV7およびHHV8））を、製造業者の指示（Euroclone、Pavia、Italy）に従っ RhyMAテストは、特定のビオチニル化プライマーとPCRによる多重DNA増幅を含む逆ハイブリダイゼーション技術に基づいていました,その後、増幅され、ビオチニル化されたDNA断片のプローブ上のストリップとのハイブリダイゼーション,ヘルペスウイルスのそれぞれに固有の. 結果の評価にはビオチン-ストレプトアビジン系を用いた最終現像反応が必要であった。 陽性および増幅対照も各ストリップに含まれていた。 結果の解釈のために、各サンプルの開発されたストリップを標準テーブルと整列させた。 RhyMAのテストヘルペスのスクリーニングは試金の高い特定性そして感受性を証明する生体外の診断使用のために認可される。 RhyMAテスト-ヘルペススクリーニングアッセイを使用して得られた結果を検証するために、PCR産物はまた、各ウイルスの予想される電気泳動パターンを産生する3％低融点アガロースゲル中で実行されました。 最後に、PCR陽性試料を直接配列決定分析に供し、RhyMA試験-ヘルペススクリーニングアッセイを用いて得られた結果を確認した。ＨＳＶ−１およびＣＭＶ ｑＲＴ−ＰＣＲを含む。＜／ｐ＞＜ｈ３＞ＨＳＶ−１およびＣＭＶ ｑＲＴ−ＰＣＲを含む。全ＲＮＡは、ＲＥＴＲＯ−ｓｃｒｉｐｔ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、オースティン、テキサス州、米国）ランダム六量体プライマーと。 ｃＤＮＡを、ｑＲＴ−Ｐｃｒ中の鋳型として各ｃＤＮＡの連続希釈を使用して標準曲線を構築することにより、鋳型品質について試験した。 CDNAテンプレートは90％〜105％のアッセイ効率を与え、すべての標準曲線のR2は>0.98であった。 逆転写の後、ｃＤＮＡを、前述のように、ＨＳＶ−１およびＨＣＭＶ ｍＲＮＡの定量のために、それぞれＩＣＰ０およびＩＥ１特異的プライマーを使用して増幅した。 全てのＱＲＴ−Ｐｃｒを、Ｍａｘｉｍａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｉｎｃ． Ａｂｉ ＰＲＩＳＭ７ ５ ０ ０配列検出器（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｎａｄａ）において、抽出されたＲＮＡ試料ならびに陽性および陰性対照を含む。 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光を、４ ０回の増幅サイクルの間に測定した。 定量化された各テンプレートについて、生成物の蓄積が線形範囲に入った平均サイクル数（Ｃ Ｔ）を計算した。 複製CT値は、互いに0.4サイクル以内であった。 所与の鋳型の１ ８ｓｒＲＮＡ ＣＴ値を、同じ鋳型からの各関心対象ｍ ＲＮＡ（ＩＣＰ０およびＩＥ１）について得られたＣＴから減算して、各鋳型についての正規化ＣＴ値（Δ Ｃ Ｔ）を得た。腫瘍壊死因子-αおよびインターロイキン-6遺伝子発現。

腫瘍壊死因子-αおよびインターロイキン-6遺伝子発現。ＴＮＦ−αまたはＩＬ−６ｍＲＮＡの定量のために、１μ ｌのｃＤＮＡを、ＤＮＡ含量のマーカーとしてＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎを使用して、２ ０μ ｌの反応において上記に示したプライマーと共に使用した。＜／ｈ３＞＜ｐ＞ 使用したプライマーは、ベータアクチン：順方向：５’−ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＧ−３’、逆方向：５’−ＴＣＴ ＣＴＴ ＴＧＡ ＴＧＴ ＣＡＣ ＧＣ Ａ ＣＧ−３’；Ｔｎｆ−ａ順方向：５’−ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＧ−３’であった。: 5′-CAC GCT CTT CTG TCT ACT GAA CTT CG-3′,リバース:5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′,11IL-6:フォワード:5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG-3′,リバース:5′-GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC-3′,リバース:5′-GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC-3′,リバース:5′-GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC-3′,リバース:5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′,リバース:5′- 反応の最後に提供された解離パターンおよびアガロースゲル電気泳動によって示されるように、副生成物は反応中に存在しなかった（データは示さない）。 TNF-αおよびIL-6生成物の増幅効率は、増幅の標準曲線によって示されるようにベータアクチンの増幅効率と同じであり、式を使用することができた: 倍の増加＝２−（Δ Ｃｔ Ａ−Δ Ｃｔｂ）。 統計的評価を可能にするために、反応を三重に行った。

結果

PCR–reverse hybridisation assayを用いて、椎間板ヘルニア患者の椎間板標本における八つの異なるヘルペスウイルスのDNAをスクリーニングした（図。 1). ヘルペスウイルスDNAは13のうち16の標本（81.25％）で検出された。 HSV-1は9人の患者（56.25％）で最も高い有病率を示したが、CMVは6人の患者（37.5％）で検出された（表I）。 二つの患者は、HSV-1とCMVの両方に同時感染しました。 HSV-2、VZV、EBV、HHV6、HHV7およびHHV8からのDNAは、患者のいずれかのディスクサンプルで検出されませんでした。 対照患者（Ｃ１およびＣ２）のいずれも、ヘルペスウイルスＤＮＡの存在について陽性を試験しなかった（図１ ０Ａ）。 1).

リアルタイムqRT-PCRによるウイルス転写産物の潜在的な発現を調べることによって、椎間板標本におけるHSV-1およびCMV感染の状態を調べた。 ヘルペスウイルス遺伝子発現は試験した試料のいずれにおいても検出されず，活性ウイルス感染がないことを示し，これらの試料における潜伏ヘルペスウイルス感染の確立を示唆した。

患者の血清陽性も検討した。 全てのＨＳＶ−１またはＣＭＶ ＰＣＲ陽性患者は、それぞれ同じウイルスに対するＩｇｇ＋抗体を提示した（表ｉ）。 HSV-1の三つのケースとCMVの六つのケースでは、IgG+抗体は、ウイルスDNAの同時有病率で検出されませんでした。 さらに、末梢血からのHSV-1およびCMV IgM+抗体は、患者のどれも外科的切除時に急性ヘルペスウイルス感染を経験していなかったことを示す、すべての患者

ヘルニア椎間板周囲の炎症の肉眼的徴候とは別に、qRT-PCRを用いてすべてのサンプルにおけるTNF-αおよびIL-6のmRNAレベルを調べることにより、椎間板 分析は、対照と比較して、試料中の両方の炎症マーカーの約2〜3倍の増加を示した（図10B）。 2). 興味深いことに、ＨＳＶ−１およびＣＭＶの両方に共感染した患者は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の最高レベルを示した。 さらに、ウイルス感染の証拠のない三人の患者（患者2および8）のうち二人は、TNF-αの低レベルを示した。 この負の相関は、これらの患者におけるIL-6レベルについては見出されなかった。

Discussion

本研究では、ヘルペスウイルス感染が椎間板変性を促進する可能性があるという概念を示唆している。 我々は、椎間板切除中に収穫されたヒト椎間板サンプルの多数のHSV-1とCMV DNAを検出することができました。

椎間板変性の原因として、以前の低悪性度の感染が示唆されている。 2,4いくつかの著者は、Modicタイプ1信号（T2重み付けMR画像の骨髄信号強度の増加とt1重み付けMR画像およびエンドプレートの線維血管組織の信号強度の減少）と感染との関係を強調している。 13,14患者が重度の背中の痛み、温度、または異常な血液プロファイルを持たない場合、Modic1の変化と低悪性度の感染とを区別することは困難である。 13,14

ウイルス感染とアポトーシスの関係は広く研究されており、ウイルスによるアポトーシス誘導のメカニズムを明らかにしている。 15,16現在、パルボウイルスB19、特にそのNS-1タンパク質は、宿主細胞に強力な細胞毒性効果を有し、感染細胞にアポトーシスを引き起こすことが知られている。 17ウイルスは、様々な形態の関節炎の病因において役割を果たす。 Stahlら5は、早期関節炎患者から採取した滑膜組織中の複数のウイルスからウイルスDNAを検出した。 最近の研究では、変形性関節症の進行段階は、パルボウイルスB19による関節軟骨の炎症および損傷の増加に関連している可能性があることが示唆 18別の研究では、ヒトパルボウイルスB19は、炎症性サイトカインおよびタンパク質分解酵素の過剰合成の過程で関節病変につながる、関節リウマチ 19

HSV-1感染症は世界中で流行しています。 成人の90％以上が50年までにHSV-1に対する抗体を持っています。 ヘルペスウイルスは、子供の遍在する病原体であり、活発な感染の後に潜伏している。 20,21感染の初期段階では、ウイルスの複製は、正常な細胞機能と互換性のあるウイルスゲノムを維持するいくつかの細胞の生存と神経節で起こる。 宿主細胞とウイルスとの間のこの細かいバランスは、様々な刺激によって妨害され、再活性化につながる可能性がある。 22

私たちの研究では、患者のいずれも急性ヘルペス感染を経験していませんでした。 これは末梢血からのＩｇｍ＋抗体の欠如による血清学的レベルとディスク試料からのウイルスｍｒｎａ転写物の欠如による分子レベルの両方で明らかであった。 したがって、小児期におけるHSV-1感染の高い有病率だけでなく、神経系におけるその保持は、椎間板におけるHSV-1とCMVの両方の存在の満足のいく説明

ウイルスが椎間板空間にどのように入るのかという疑問が生じます。 大きな血管チャネルは、出生とともに減少し、四から六歳までに完全に消失し、椎間板を体内で最大の無血管組織タイプの一つにする、初期の胎児の生活の間にエンドプレートを横断することは十分に確立されている。 23椎間板内のウイルスDNAの存在は、椎間板環境がまだ血管が豊富である間に、小児期にウイルスDNAを含むマクロファージまたは他の細胞の椎間板への 単純ヘルペスウイルスは、IL-1やTNF-α24,25などの炎症性サイトカインによって神経軸索で活性化され、抗ドロマイル遊走を介して椎間板空間を含む可能性があることがよく知られているため、他のメカニズムも役割を果たす可能性がある。

このように、炎症を起こしたまたは損傷した椎間板は、様々な炎症性サイトカインを産生し、潜伏ウイルスを活性化する。 これらの機構はまた、ディスクサンプル中の二つ以上のウイルスからのDNAの存在を説明することができ ウイルスの存在が二次的な現象であっても、ウイルス抗原は、活性化されたマクロファージおよび他の細胞が組織損傷を引き起こすのを容易にする炎症性環境の活性化によって椎間板の劣化をさらに促進するので、それらの存在は椎間板変性の病因に寄与する可能性がある。

我々の研究では、手術場の手術内評価は、椎間板ヘルニアを取り巻く炎症の巨視的証拠を明らかにした。 椎間板標本における炎症の証拠および炎症過程の増強へのウイルス感染の寄与は、TNF-αおよびIL-6などの炎症に関連するよく知られた遺伝子のmRNAレベ 両方の炎症マーカーは、コントロールと比較して、患者のサンプルで約二から三倍の高いレベルを示した。 興味深いことに、ＨＳＶ−１およびＣＭＶの両方によって共感染された試料は、ｔｎｆ−αおよびＩＬ−６の最高レベルを示し、ウイルスの相乗効果を示唆した。 さらに，ＴＮＦ-αのレベルは，ウイルスＤＮＡを検出できなかった患者の対照例と同じくらい低かった。

最近のレビュー記事では、椎間板変性は診断ではなく、個々または集合的に作用するいくつかの要因の結果である椎間板の状態の表現であると述べて 椎間板変性は、単一のプロセスの結果ではなく、機械的、老化、遺伝的、全身的、毒性および／または感染を含む多くの考えられる原因を有することができる。 私達の16人の患者のすべてのウイルスの検出の不在はディスク脱出のmultifactorial原因と一致してあります。 遺伝的要因がマトリックス26-28の異常な成分を産生することが知られており、これはディスクの構造と機能を損ない、ディスク組織の機械的ストレスへの感受性を増加させる。 29疫学的研究では、遺伝的要因が変性のリスクを増加させることが示されています,30-35しかし、彼らはすべてのケースを説明していません,28,36異なる民族集団間の変動と37そのような大規模な多民族集団の研究が必要とされています. 38

ディスク内のウイルスの存在は、ディスクが機械的ストレスや外傷による損傷に対して脆弱である設定を作成する可能性があります。 ウイルスDNAは椎間板レベルで存在する可能性が高いが、変性に寄与すると仮定される機械的ストレスは、問題がはるかに一般的な腰仙レベルで起こ 1遺伝的影響の有無にかかわらず、低悪性度の感染は、二次的に椎間板変性をもたらす生物学的事象を駆動する環境要因に対する椎間板の感受性を おそらくヘルペスDNAは、アポトーシスと局所炎症反応を調節することによって椎間板内のマトリックスの構造特性を変化させる因子として作用し、ウ

Helicobacter pyloriによる感染が胃潰瘍の発症に関与していることをMarshallとWarren39が発見したことは、医学的理解の大きな変化につながります。 感染過程が椎間板変性に寄与する可能性は真剣に考慮すべきである。

我々は、これが椎間板ヘルニア患者の椎間板におけるヘルペスウイルスの存在を文書化した最初の研究であると考えている。 基礎となるメカニズムを決定し、椎間板変性疾患の病因におけるヘルペスウイルスの潜在的な役割を支持するためには、さらなる研究が必要である。

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