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바이러스 경험을 확실히 다른 환경이 있는지 여부에 따라 복제 내부 호스트 세포 또는 운송에서 하나의 호스트하는 다른. 내 셀,바이러스 및 바이러스 구성 요소들에 노출을 감소 환경 redox 잠재적인 결정에 의해 주로 글루타티온(18). 반면에,외부세포,바이러스에 노출되는 산소 및 유독한 제품에서 파생된 산소,과산화 수소와 같은,초과,그리고 hydroxyl radical,민감하는 종이 있는 잠재적인 바이러스를 활동하지 않기 위하여. 이러한 반응성이 높은 화합물에 대처하기 위해 식물과 동물은 무독성 제품으로 전환 할 수있는 효소를 발현합니다. 이러한 효소의 예로는 카탈라아제,퍼 옥시다아제 및 슈퍼 옥사이드 디스 뮤타 아제(28)가있다. 여기,우리는 정제 된 단순 포진 비리 온 내부의 카탈라아제의 존재를 입증하는 연구 결과를 설명합니다. 그런 다음 내부 카탈라아제가 h2o2 에 의한 불 활성화로부터 바이러스를 보호 할 수 있는지 여부를 확인하기위한 테스트가 수행되었습니다.

연구의 catalase 수행되었으로 포진 심플렉스 바이러스 1(HSV-1)성장에 베로 세포에서 문화를 정제하여 자당 밀도 구배용 원심 분리. 바이러스 현탁액이 1%H2O2 로 조정되었을 때,산소의 기포가 신속하게 형성되기 시작하여 카탈라아제의 존재를 나타냈다(그림 1). 1a,왼쪽 튜브). 거품은 실온에서 몇 초간의 배양 후 육안으로 분명 해졌고 적어도 20 분 동안 계속 형성되고 확대되었다. 거품을 형성했다,그러나,경우의 카탈라아제 억제물 아지드화 나트륨 추가되었는 바이러스 서스펜션 전 H2O2 치료(Fig. 1a,오른쪽). 분석 실험한 부정적인 경우(i)바이러스가 제거된 솔루션에서 원심분리하여 추가 전에 H2O2 또는(ii)HSV-1capsids(B capsids)을 대체하는 그대로 바이러스입니다. 비슷한 분석 실험을 거의 존재를 나타내는 catalase 관찰되지 않았으로 정화된 기공을 구염 바이러스 또는 인간의 아데노 2(데이터시하지 않음). Western blot 분석은 hsv-1 바이러스와 관련이 있지만 아데노 바이러스,수포 성 구내염 바이러스(VSV)또는 HSV-1a 캡시드와 관련이없는 카탈라아제의 존재를 확인했다(도 1). 1b).

효소 분석(a),웨스턴 블롯 분석(b)및 수 크로스 밀도 구배 원심 분리(c)에 의한 HSV-1 관련 카탈라아제의 식별. 패널여 튜브가 포함된 정화 HSV-1 20 분 후 솔루션을 조정하여 1%H2O2(왼쪽 튜브)와 이와 유사한 부화하는 카탈라아제 억제물(2mM 아지드화 나트륨)이었 추가하기 전에 H2O2(오른쪽). 바이러스에 카탈라아제가 존재 함을 나타내는 왼쪽 튜브에 기포 형성에 유의하십시오. 바이러스 농도는 TNE(0.01M Tris-HCl,0.5M NaCl,1mM EDTA,pH7.5)에서 0.25mg/ml 였고,배양은 실온에서 하였다. 바이러스가 코스의 변형 HSV-1,which was 에서 성장 단층 문화의 Vero 세포를 정제하여 자당 밀도 구배용 원심 분리,그리고 역가 결정되었으로 끝점 희석 앞에서 설명한 대로(14)입니다. 패널 b 는 HSV-1,인간 아데노 바이러스 2(HAd2),수포 성 구내염 바이러스(VSV)및 HSV-1a 캡시드에서 카탈라아제의 존재에 대한 웨스턴 블롯 테스트의 결과를 보여줍니다. 인간 아데노 바이러스 2 및 수포 성 구내염 바이러스(인디애나; San Juan 균주)를 각각 HeLa 및 Vero 세포의 단층 배양 물에서 재배하고 이전에 기술 된 절차에 의해 정제 하였다(12,17). 출판 된 방법은 또한 HSV-1A 및 B 캡시드의 정제에 사용되었다(23). 주요 캡시드 단백질이 발견되었으로 염색으로 얼룩 1%개양귀비 S(상단),동 catalase 에 의해 발견되었 immunostaining 으로 항체 특정한 카탈라아제(Calbiochem;rabbit polyclonal219010;1:5,000 희석)(15). 카탈라아제는 HSV-1 바이러스에서 검출되었지만 had2,VSV 또는 HSV-1a 캡시드는 검출되지 않았다. 패널 c 는 자당 밀도 구배 분석 결과를 보여줍니다. 50μl TNE 에서 정제 된 HSV-1 의 총 50μg 을 tne 에서 20%내지 50%자당의 600-μl 구배에서 원심 분리 하였다. 원심 분리되었을 위해 45 분에서 22,000rpm 에 베크 SW55 회전자에서 4°C 로 기울였 분류 및 개인 분수에 의해 분석되었 SDS 페이지 다음종에 폴리비닐 difluoride(PVDF)및 염색으로 1%개양귀비 S. 시킨 다음 destained 과 스테인드와 함께 항체 특정한 카탈라아제(는 우연히 마이그레이션과 함께 표준 catalase;Worthington LS001872). 그라디언트(맨 위 줄)에서 바이러스의 위치는 카탈라아제(맨 아래 줄)의 위치와 일치하여 두 가지가 연관되어 있음을 시사합니다.

제어 실험을 실시했는지 확인하 catalase 와 관련이 있었 HSV-1 과 함께 불순물 존재에서 바이러스 준비합니다. 정화 HSV-1 원심 분리되었으로 밴드에 자당 밀도를 기울,그라데이션었 분류 및 Western blot analysis 사용되었을 테스트하는 개인 그 분획의 존재에 대한 catalase. 결과는 카탈라아제가 바이러스 함유 분획물에는 존재했지만 측면 분획물에는 존재하지 않았 음을 보여 주었다(도 1). 1 기음). 결과를 해석하는 것을 나타내는 카탈라아제와 관련 HSV-1 과하지 않으로 오염 물질을 등 catalase-을 포함하는 박테리아나 호스트 세포자료에서 바이러스 준비합니다. HSV-1 게놈은 카탈라아제(22)를 암호화하지 않기 때문에 바이러스 관련 효소는 숙주 세포에서 유래해야합니다. Vaccinia 바이러스에 대한 초기 연구는 성숙한 비리 온(8)내부에 카탈라아제가 존재 함을 입증했습니다. 이 관찰과는 별도로,우리는 바이러스 구조의 구성 요소로서 카탈라아제에 대한 다른보고를 알지 못한다.

HSV-1-관련 카탈라아제의 추가 분석은 비리 온에서 효소의 위치를 결정하는 것을 목표로 하였다. 두 가지 유형의 실험이 수행되었습니다. 첫째,정제 바이러스 치료 단백질 분해효소 pronase 을 저하시키는 바이러스 당단백질 및 단백질 내에 포함되지 않 virion 막을 수 있습니다. 프로나 제가 바이러스 지질 이중층을 가로 지르지 않기 때문에 내부 바이러스 단백질은 영향을받지 않을 것으로 예상되었다(16). 프로나제 처리 후,바이러스는 원심 분리에 의해 수확되었고,카탈라아제 손실의 정도는 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었다. 결과는 시험 된 바이러스의 두 가지 농도에서 카탈라아제 손실의 증거를 보여주지 못했다(도 1 의 카탈라아제 밴드 참조). 2a,차선 1 및 2). 내부 대조군은 바이러스 표면 당 단백질 gB 및 gH 가 예상대로 절단되었음을 보여 주었다(도 1). 2a;차선 2 와 3 비교). 유사하게,Western blot 분석은 카탈라아제가 영향을받지 않는 조건 하에서 hsv-1 당 단백질 D 가 pronase 또는 trypsin 에 의해 소화되었음을 입증했다(도 1). 2b). 용액 중의 정제 된 카탈라아제도 동일한 조건 하에서 소화되었다. 대조적으로,내부 tegument(UL47,UL48 및 UL49)또는 캡시드 단백질(UL19,UL38,UL18;Fig. 2a,레인 1 및 2)가 관찰되었다. 결과는 카탈라아제가 HSV-1 봉투 안에 위치한다는 것을 나타내는 것으로 해석됩니다.

의 현지화 catalase 에 HSV-1 의 치료에 의해 정화된 비리와 pronase(선 1 부 3)및 트리톤 X100(a,차선 4,5)에 의해 pronase 과 트립신 트리트먼트(b,차선 1 부 3)입니다. 패널 a 는 pronase(레인 1 및 2)및 트리톤 X-100(레인 5)으로 처리 한 후 손상되지 않은 HSV-1(레인 3 및 4)및 비리 온에 존재하는 단백질의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 보여줍니다. Note catalase 었 있는 것을 발견에서 그대로 비(레인 3 및 4)및 pronase 처리 비(1 차와 2)하지만 비리와 치료 후 1%Triton X100(레 5). Pronase 치료에 의해 실시되었을 소화 정화 HSV-1(0.25mg/ml)1mg/ml pronase(Streptomyces griseus;Calbiochem537088)4h37°C. 후 pronase 치료,바이러스 reisolated 에 의해 자당 밀도 그 원심분리하기 전에 SDS 페이지와 Western blot analysis. 트리톤 X-100 처리는 정제 된 바이러스를 10mM 디티 오트레이톨(DTT)을 함유하는 TNE 완충액에서 1%트리톤 X-100 으로 조정하고 얼음(4°C)에서 15 분 동안 배양함으로써 수행되었다. 이어서,생성 된 캡시드를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 전에 수크로오스 구배 원심 분리에 의해 정제 하였다. (b)pronase 또는 trypsin 으로 시험 관내에서 치료 한 후 정제 된 HSV-1 의 웨스턴 블롯 분석. 총 100μl 의 정제 된 HSV-1(1mg/ml)을 2mg/ml pronase 또는 2mg/ml 트립신으로 조정 하였다. 대조군 배양에는 효소가 없었다. 혼합물이 배양되었 2h37°C 며,비리제에서 효소에 의해 원심분리 20%~50%자당 그라데이션에 설명된 대로 전하는 그림. 1. 바이러스 표본을 원심 분리에 의해 펠렛 화하고 SDS-PAGE 및 Western blot 분석에 의해 조사 하였다. 오점은 카탈라아제(토끼 폴리 클로 날)를 위해 염색되었다; 상기 참조)및 당단백질 D(마우스 단클론 항체 DL11;게리 코헨 및 로젤린 아이젠버그의 선물;1:5,000). 프로테아제 처리는 당 단백질 D 의 소화를 일으켰지 만 카탈라아제는 아니지만 카탈라아제가 HSV-1 막 내부에 위치 함을 나타냅니다.

더 정확한 정의의 위치에 대한 카탈라아제에 의해 얻은 치료의 정제 바이러스와 비이온성 세제 Triton X100(TX-100). 을 때 수행되는 신선한 바이러스,이 치료의 손실을 일으키는 원인이 바이러스 멤브레인,membrane glycoproteins,그리고 거의 모든 20 개 또는 더 tegument 단백질(모든지만 UL36,UL37 및 US3)(13,21,27). 그러나 캡시드는 무결성을 유지하며 주요 캡시드 단백질 중 어느 것도 손실되지 않습니다. 바이러스 DNA 는 캡시드 내부에 유지됩니다. 실험은 hsv-1 을 1%TX-100 으로 처리하고 수 크로스 밀도 구배 원심 분리에 의한 결과 캡시드의 분리를 포함했다. 그런 다음 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 카탈라아제의 존재에 대한 캡시드를 테스트했습니다. 결과는 바이러스 당 단백질 및 테구 멘트 단백질이 예상대로 제거되었고 카탈라아제도 제거되었음을 입증했다(도 1 참조). 2a,차선 4 및 5). 이 실험은 카탈라아제가 HSV-1tegument 에 존재 함을 나타내는 것으로 해석됩니다.

도 1 에 도시 된 것과 같은 정보. 2 는 hsv-1 비리 온 당 카탈라아제 분자의 수를 결정하는데 사용될 수있다(15). 이 측정은 정제 된 바이러스의 두 개의 동일한 분출로 시작하여 수행되었습니다. 두 위해 사용되었다의 결정은(i)수의 주요 캡시드 단백질 분자(UL19)에서 Coomassie 블루 스테인드 젤 및(ii)수의 60-kDa catalase 분자에서 교정 Western blot. 대표적인 결정에서,이 분석은 ul19 에 대한 카탈라아제의 몰비에 대해 1:207.5 의 값을 산출했다. HSV-1 캡시드 당 955 개의 UL19 분자가 존재하기 때문에 캡시드 당 카탈라아제 분자의 수는 955/207.5 또는 4.6 으로 결정되었다. 두 번째 유사한 결정은 7.1 카탈라아제 분자의 값을 산출했다. 활성 카탈라아제 분자(11,20)에 4 개의 60-kDa 서브 유닛이 있기 때문에,결과는 비리 온 당 1 내지 2 개의 카탈라아제 테트라 머의 존재를 나타낸다.

hsv-1 비리 온 내부의 카탈라아제의 존재는 h2o2 에 의한 산화 적 손상으로부터 바이러스의 보호에 관여 할 수있는 가능성을 시사한다. 또한,catalase 할 수 있는 수동적으로 통합 HSV-1 로 tegument 추가되는 호스트에서 셀룰라질지 모든 보호 기능이 있습니다. 두 가지 가능성을 구별하기 위해,우리는 h2o2in vitro 에 의한 불 활성화에 대한 정제 된 HSV-1 의 민감도를 조사했다. HSV-1 었으로 처리 H2O2 에서 존재의 카탈라아제 억제물 아지드화 나트륨(NaN3),및 바이러스가 결정된 이후(에서 부재의 카탈라아제 억제물). 결과는 50mM H2O2 가 역가의 완만 한 감소(3 배에서 4 배)를 생성하는 반면,NaN3 이 존재하는 경우 106 배 이상의 치명적인 효과가 관찰되었음을 보여 주었다(표 1). 대조군 실험은 NaN3 단독에 의한 HSV-1 의 살상을 거의 나타내지 않았다(표 1). 결과는 카탈라아제가 H2O2 에 의한 HSV-1 의 불 활성화에 대해 상당한 수준의 보호를 제공한다는 것을 나타내는 것으로 해석된다.

그것이 예상되지 않습니다 HSV-1 것이 보호해야에서 산화에 의해 손상이 H2O2 는 동안 그것은 그와 관련된 호스트 세포입니다. 전술 한 바와 같이,환원 환경은 세포 내에서 발견되며,이는 H2O2 의 형성을 방지 할 것이다. 그러나 숙주 세포 밖에서는 환경이 산화되어있어 바이러스 내부와 주변 매질 모두에서 H2O2 를 생성 할 수 있습니다. HSV-1 은 한 호스트에서 다른 호스트로 전달됨에 따라이 환경을 접하게되며,카탈라아제는 운송 중에 HSV-1 감염성의 보호에 관여 할 수 있습니다. HSV-1 관련 카탈라아제는 또한 상등 박테리아 또는 다른 공급원에 의해 생성 된 H2O2 로부터 보호를 제공 할 수있다. 예를 들어 유산균에 의해 생성 된 H2O2 는 미생물 감염으로 인한 질병으로부터 여성 생식기를 보호하는 것으로 입증되었습니다(4). 높은 촉매 속도 때문에 바이러스 관련 카탈라아제는 낮은 카피 수(비리 온 당 1~2 카피)에도 불구하고 HSV-1 의 보호에 역할을 할 수 있습니다. 예를 들어 간 카탈라아제는 모든 효소(2)에 대해보고 된 가장 높은 촉매 속도 중 초당 수천만 개의 H2O2 분자를 해독 할 수 있습니다.

헤르페스 계열의 모든 바이러스는 바이러스 캡시드와 막 사이에있는 단백질 층인 tegument 를 가지고 있습니다(5, 6, 9, 13). HSV-1tegument40 50nm 에 두께로 구성되어 약 20 개 종 단백질,거의 모두에서 인코딩된 바이러스 게임입니다. Tegument 단백질을 실질적으로 다르에서 자신의 풍요 로움에서 virion800 복사본이나 이상의 주요 종,등 UL47,UL48 및 UL49(그림을 참조하십시오. 2a,레인 3)(5,16). 많은 tegument 단백질에 참여하고 있 초기 단계 HSV-1 복제,과 같이 활성화의 초기 유전자의 전사하고 감쇠의 호스트 세포 단백질 합성(13,24,25). Tegument 는 TRANS-Golgi 네트워크(10)의 소포로 DNA 함유 캡시드 새싹으로 초기 HSV-1 비리 온으로 조립된다. 카탈라아제가 싹 트는 과정에서 다른 tegument 단백질과 함께 통합되는 것이 제안된다.

감염되지 않은 세포에서,대부분의 카탈라아제는 퍼 옥시 좀(26)에서 격리되어 발견된다. 기 위해서는 통합함으로 자손 HSV-1 동안 tegumentation 위에서 설명한 대로,catalase 될 필요에서 출시 peroxisomes. 우리는 이것이 HSV-1 복제를 수반하는 세포질 막의 대규모 재 배열의 결과로서 일어날 수 있다고 제안한다(1).

팔라마라 외. (19)는 vero 세포가 HSV-1 에 감염된 후 세포질 글루타티온 농도의 감소가 신속하게 발생한다는 것을 입증했다. 글루타티온 농도의 감소는 세포 환원 전위의 감소를 유발할 것으로 예상되며,이 감소는 HSV-1 복제를 전위시키는 것으로 보인다. 성장 배지에 제공된 여분의 글루타티온은 HSV-1 성장에 길항하는 것으로 밝혀졌다(19). 외부 적으로 첨가 된 글루타티온과 마찬가지로,cytosolic catalase 는 H2O2 를 제거하여 세포질의 감소 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 그것은 제안에 따라서 하나의 결과 catalase 으로 설립 자손 비 될 수 있을 강화시킬 바이러스 성장을 박탈에 의해 감염된 세포의 catalase.

비리 온 당 카탈라아제 분자의 수가 적 으면 전체 HSV-1 비리 온(7)의 질량 분석 분석에서 검출되지 않은 이유를 설명 할 수 있습니다. 여러 가지가 있는 고 복사 수 HSV-1virion 단백질이 수명에서 신호 catalase(예를 들어,거기에 수천개의 당단백질 분자와 955 사본의 주요 캡시드 단백질). 카탈라아제의 풍부함은 질량 분석법(Coomassie-sted SDS-PAGE gel 에 대한 가시성)에 의한 검출을위한 비공식적 인 표준을 충족시키지 못합니다. Hsv-1 의 질량 분석 분석에서 항산화 활성을 갖는 peroxisomal 단백질 인 Peroxiredoxin 이 검출되었다(7,26).

미래에는 H2O2 의 세포 독성 효과에 대한 HSV-1 의 민감도를 이용하는 것이 가능할 수 있습니다. 이 바이러스는 숙주 세포 외부의 산화 환경에있을 때와 카탈라아제가 억제 될 때 특히 취약 할 것으로 예상됩니다.