Taq polymerase Er en av de mest allestedsnærværende enzymer i molekylærbiologi. Siden oppdagelsen I 19651 Har Taq blitt ryggraden I PCR og alle nedstrøms applikasjoner som teknologien muliggjør. Denne kraftige polymerase er standardvalget for de fleste amplifikasjon og kloning prosedyrer, samt diagnostiske tester, markør genet DNA-sekvensering, og mye mer.

Hva gjør Taq polymerase så spesiell? I dagens artikkel tar vi en titt på fordelene Og ulempene Ved Taq, hva du trenger for å få de beste PCR-resultatene Fra Taq polymerase, og noen Taq-derivater som kan hjelpe deg med å oppnå bedre resultater for spesialiserte applikasjoner.

Hvorfor Er Taq Så Mye Brukt TIL PCR?

Taqs popularitet drar nytte av det faktum at Det var den første høy temperatur polymerase oppdaget av molekylærbiologer. Men det er langt fra den eneste grunnen til at det fortsatt er så høy etterspørsel i dag.

Taq polymerase har den viktige egenskapen ved å være stabil ved temperaturer opp til 95°C2. Det er kritisk fordi dette er temperaturen DER DNA denatures – et nødvendig trinn i begynnelsen AV PCR-reaksjonen. Mens en moderat temperatur polymerase også vil denaturere ved den temperaturen, noe som gjør Den ubrukelig, Forblir Taq helt klar til å begynne å polymerisere mål-DNA-prøven.

I Tillegg Har Taq fordelen av å være mest aktiv i temperaturområdet 70-80°C2. DET er varmt nok TIL AT DNA ikke vil reanneal, men primere som har glødet ved lavere temperaturer, vil heller ikke skrelle av. Så, Taq polymerase fungerer svært godt ved temperaturer mest standard PCR reaksjoner krever.

Endelig Passer Taq grunnleggende molekylærbiologi behov ekstremt godt. Polymerasen forlater A-tailed produkter, som lett kan klones til en vektor ved hjelp AV et standard TA kloningssett. Taq er også relativt motstandsdyktig MOT DNA-sekvenser med et bredt spekter AV GC-innhold og er ikke alt som kresen om mål-DNA eller dNTP-konsentrasjoner.

Hva Trenger Taq Å Polymerisere Effektivt?

hvis Du bare la Taq polymerase på egen HÅND til EN PRØVE AV DNA, ville ikke mye skje. Det er fordi Som de fleste enzymer, Taq trenger en spesialisert blanding av reagenser for å fungere skikkelig.den grunnleggende Taq-bufferen inkluderer kaliumklorid, Trishydroklorid og Triton X-100. Disse kjemikaliene er mindre relevante for å optimalisere PCR – reaksjonene enn å holde Taq trygt under lagring i fryseren-noe som i seg selv er viktig for å få mest mulig ut av Pcr-ene. Mens du kan lage din egen buffer for å rehydrere Og lagre lyofilisert Taq enzym, selges det store flertallet av polymerase som en master mix med Taq allerede suspendert i den nødvendige bufferløsningen.

mer kritisk TIL PCR-reaksjonene er magnesiumklorid. Magnesium er en viktig kofaktor For Taq polymerase3. Uten Det Vil Taq ikke kunne katalysere tilsetning av nukleotider til primeren eller voksende DNA-streng. Konsentrasjonen av magnesium er også viktig. Etter hvert som mer magnesium legges TIL EN PCR-reaksjon, Blir Taq mer aktiv, men også mindre spesifikk ved polymerisering av bare din MÅL-DNA-streng.

på grunn av den konsentrasjonsavhengige rollen som magnesium, kan Du finne Taq master-blandinger med magnesium som allerede er inkludert, samt blandinger som utelater Det. I sistnevnte tilfelle må du legge til magnesiumklorid separat (som krever et ekstra pipetteringstrinn når Du forbereder Pcr-ene). Fordelen er at du kan kontrollere den nøyaktige konsentrasjonen av magnesium, slik at du kan eksperimentere for å finne den mest optimale blandingen Av Taq produktivitet og spesifisitet.

Hva Er Problemene Med Taq Polymerase?

Taq er mye brukt for rutinemessige Pcr, men dessverre er det ikke perfekt for alle applikasjoner. Den mest bemerkelsesverdige ulempen Ved Taq er at Det ikke er den mest nøyaktige polymerasen der ute. Taq har en feilrate på rundt en feil per 100 000 basepar4. Til sammenligning Er pfu korrekturlesingspolymerase omtrent 10 ganger mer nøyaktig. HVIS DU bruker PCR oppstrøms for kloning eller DNA-sekvensering, kan forskjellen i feilfrekvens være svært viktig.

Standard taq polymerase kan også ha problemer med å forsterke mål-DNA-sekvenser lengre enn ca 1 kB. I forhold til andre typer polymeraser Har Taq lav prosessivitet, noe som betyr at effektiviteten avtar betydelig med lengden på amplicon. Denne lave prosessiviteten kan bli verre av tilstedeværelsen AV PCR-hemmere, som er vanlige hvis DU jobber MED DNA ekstrahert fra vev, planter eller jord.

til Slutt, Mens Taq-polymerase er mest effektiv ved temperaturer over 70°C, fortsetter enzymet å fungere ved temperaturer under 50°C. det er problematisk fordi Taq utilsiktet kan polymerisere primere eller ikke-mål-DNA-sekvenser når temperaturen i PCR-reaksjonen faller for å tillate primere å annealere til målsekvensen. Som et resultat, Taq er kjent for å produsere primer dimere og andre uønskede produkter som kan komme i veien for nedstrøms programmer som kloning.

Spesialiserte Taq Polymeraser for Avanserte Applikasjoner

Heldigvis finnes det spesialiserte former For Taq polymerase som løser noen av disse problemene. For eksempel er highQu ALLin taq polymerase en syntetisk versjon Av Taq som har mer prosessivitet enn standard Taq. Som et resultat kan du lettere oppnå amplicon-utbytter fra høy-GC-maler, maler som er lengre enn 1 kB, og prøver med moderate konsentrasjoner av inhibitorer.en annen vanlig Form For Taq, Som ALLin Hot Start Taq, er konstruert med en molekylær inhibitor for å gjøre den inaktiv ved lavere temperaturer. Hot start Taq fungerer bare etter oppvarming til 95°C. det reduserer dramatisk dannelsen av primerdimere og ikke-spesifikke amplikoner som følge av polymerisering før STARTEN AV PCR-reaksjonene. Som et resultat, kan du få høyere avkastning når du arbeider med lengre målet sekvenser og kutte ned på bakgrunn amplicons som normalt krever opprydding.

Konklusjon

Taq polymerase har lenge vært det valgte enzymet for både rutinemessige OG komplekse PCR-applikasjoner. Den passer perfekt til KRAVENE TIL PCR-reaksjonen, samtidig som det gjør nedstrøms applikasjoner som kloning og sekvensering enkelt. Selv om standard Taq har noen ulemper, løses disse i stor grad ved å bruke en konstruert Eller varm start Taq polymerase. For de aller fleste applikasjoner forblir Taq polymerase go – to enzymet for molekylærbiologer.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Grenser I Mikrobiologi 5:465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostisk Molekylær Patologi: En Guide Til Anvendt Molekylær Testing.

3 Williams M. 2018. Vitenskap

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molekylærbiologi Internasjonal 287430.