I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
Enzymatiske Reaksjoner: (bilder åpnes i et nytt vindu)

• Polymerisering
• Korrekturlesing
• Primer Fjerning

DNA polymerase jeg deltar i Dna-Replikasjon av prokaryoter. DNA kjeden vekst er i 5′ til 3 ‘retning med tillegg på 3’ hydroksyl slutten. Den nye kjeden er base-parret med malen, og den nye kjeden og malen er antiparallell. DNA polymerase I ER den mest omfattende polymerase og funksjoner for å fylle hull I DNA som oppstår under DNA replikasjon, reparasjon, og rekombinasjon.

Historie:

DNA polymerase jeg ble oppdaget Av Arthur Kornberg et al. i 1956. Hans første resultater ble først presentert på det årlige møtet I 1956 I Federation Of American Societies For Experimental Biology (FASEB) I Atlantic City, New Jersey. Anmeldere av hans første papir antydet at forfatterne refererer til produktet som ‘ polydeoksyribonukleotid ‘snarere enn’DNA’; ‘DNA’ ble bare godkjent etter en appell Til sjefredaktør John Edsall (Friedberg 2006). Ytterligere to artikler ble utgitt i 1958 av Lehman et al. Og Bessman et al., som definitivt etablerte DNA-polymerase utførte DNA-replikasjon. Kornberg ble tildelt Nobelprisen I 1959 for sin oppdagelse AV DNA-polymerase I.

I 1969, Jovin et al. belyst aminosyresammensetningen (Jovin et al. 1969a, b). Samme år, DeLucia Og Cairns isolert En E. coli-stamme med en mutasjon som påvirket DNA-polymerasen og overraskende fant at mutanten syntetiserte DNA normalt. Denne oppdagelsen tviler på DNA-polymerasens rolle i replikering og ledet grupper til å søke etter andre replikasjonsenzymer. Samtidig viste Klenow og kollegaer at behandlingen AV DNA-polymerase med det proteolytiske enzymet subtilisin (Type Carlsberg) resulterte i en økning av polymeraseaktivitet og reduksjon av eksonukleaseaktivitet. DEN resulterende dna-polymerase ble isolert og ble kalt «Klenow fragment» (Klenow og Henningsen 1970a, Og Klenow og Overgaard-Hansen 1970). I 1970 ble DNA-polymerase II av E. coli isolert og preget Av Arthur Kornbergs sønn, Thomas Kornberg (Kornberg and Gefter 1970). DNA polymerase II ble også uavhengig rapportert Av Knippers og Av Moses Og Richardson i 1970 (Moses og Richardson 1970b). Et år senere identifiserte Thomas Kornberg OG Gefter DNA polymerase III (Kornberg og Gefter 1971).

Nylig arbeid MED DNA polymerase I har inkludert å undersøke det molekylære grunnlaget for substratspesifisitet gjennom termodynamiske studier (Wowor et al. 2010) og enkeltmolekylære FRETEKSPERIMENTER (Santoso Et al. 2010). Hastings et al. har undersøkt samspillet mellom de fem E. coli DNA-polymeraser under cellulær stress (Hastings et al. 2010), Og Kukreti et al.s studier har som mål å avgjøre hvilke rester som er viktige for 3′ -5 ‘ eksonukleaseaktivitet (Kukreti et al. 2008).

Spesifisitet:

DNA-syntese krever en primerstreng med en fri 3 ‘ – hydroksylterminal annealed TIL EN DNA-malstreng og deoksynukleotidtrifosfater danner basepar med malen. Tillegg er i 5’ til 3 ‘ retning med frigjøring av pyrofosfat. Enzymet er aktivt Med Dnaer som inneholder enkeltstrengede hull og også Med Dnaer med enkeltstrengbrudd eller nicks. UNDER noen forhold kan RNA-DNA-hybrider og en rna-dupleks tjene som mal-primer (Setlow 1972).

5′ til 3′ eksonukleaseaktiviteten assosiert MED DNA-polymerase i nedbryter både enkelt-OG dobbeltstrenget DNA i 5′ til 3 ‘- retningen, noe som gir 5 ‘ – mononukleotider. 5’ til 3 ‘eksonukleaseaktiviteten er spesifikk for dobbeltstrenget DNA, som gir 5’ – mononukleotider og oligonukleotider. DNA polymerase i kan også aksessere feilaktige regioner I DNA (Setlow 1972).den lignende strukturen AV DNA-polymeraser har indikert at DE FLESTE DNA-polymeraseenzymer bruker en identisk to metallion-katalysert polymerasemekanisme. En metall ion aktiverer primer 3 ‘ – OH for angrep på a-fosfat av dNTP. Den andre metallionen stabiliserer den negative ladningen av oksygen som forlater og chelater b-og g-fosfatene (Steitz 1999). Klenow-fragmentet er et proteolytisk produkt av E. coli DNA-polymerase I som beholder polymerisering og 3’ til 5 ‘eksonukleaseaktivitet, men har mistet 5’ til 3 ‘ eksonukleaseaktivitet. DNA-polymerase I ER det dominerende polymeriserende enzymet som finnes I E. coli. Den inneholder en enkelt disulfidbinding og en sulfhydrylgruppe (Jovin et al. (1969b). Fem forskjellige DNA-polymeraser har blitt isolert Fra E. coli og har blitt betegnet I, II, III, IV og V. DNA-polymerase i-funksjoner for å fylle DNA-hull som oppstår under DNA-replikasjon, reparasjon og rekombinasjon. DNA polymerase II fungerer også i redigering og korrekturlesing hovedsakelig i lagging strand (Kim et al. 1997, Wagner og Nohmi 2000). DNA-polymerase III ER det viktigste replikative enzymet. DNA polymerase IV og V har store aktive områder som gir mulighet for mer base misincorporation, og er derfor mer utsatt for feil. De mangler også korrekturlesing-eksonuklease-underenheter for å korrigere misincorporations (Nohmi 2006, Og Hastings et al. 2010). DNA-polymerase V er tilstede på signifikante nivåer bare I sos-induserte celler og overuttrykk begrenser DNA-syntese (Marsh and Walker 1985). domeneformen til alle polymeraser hvis strukturer er kjent, har blitt beskrevet som en «høyre hånd» med «tommel», «palm» og «finger» domener (Kohlstaedt et al. 1992). Palmregionen antas å katalysere fosforyloverføringen, og fingerregionen antas å interagere med det innkommende nukleosidtrifosfat og malbasen den er paret til. Tommelen antas å bidra til å posisjonere DNA og i translokasjon (Brautigam And Steitz 1998).

Molekylære Egenskaper:

genet som koder FOR DNA-polymerase i (polA) inneholder omtrent 3000 basepar og koder for omtrent 1000 aminosyrerester i en enkel polypeptidkjede. Selv organismer adskilt av en milliard år med evolusjon (Som Deinococcus-Thermus slægter og E. coli) har omtrent 35% aminosyreidentitet og omtrent 50% homologi (Patel et al. 2001).

Protein Tiltredelse Nummer: P00582

Molekylvekt:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Klenow fragment: 70 kDa (gel filtrering, Klenow og Overgaard-Hansen 1970)

Optimal pH:

• Maksimal aktivitet oppnås ved pH 7,4 med kaliumfosfat buffer for native DNA eller poly dAT mal-primer systemer (Richardson et al. 1964)
• Klenow fragment: Maksimal aktivitet oppnås ved 7,4 med fosfatbuffer og ved 8.4 Med Tris-HCl buffer

Isoelektrisk Punkt:

• 5,40 (Teoretisk)

Utryddelseskoeffisient:

Aktivatorer:

• en divalent kation er nødvendig for aktivitet
• Mg2+ ved en konsentrasjon på 7 mM gir optimal aktivitet under betingelsene i standardanalysen(Richardson et al . 1964)
• Mn2 + kan delvis oppfylle metall ion kravet
• Enzymaktivitet er også påvirket av konsentrasjoner av monovalente kationer Som K+, Rb+, Cs + OG NH4 +

Inhibitorer:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• Høy andel inkorporering av radioaktivitet for nick oversettelse analyser
• standard referansemateriale for studier AV DNA-polymeraser
• Produksjon av vekslende kopolymerer som poly d(A-T) og homopolymerer som poly dG-poly dC
• Klenow fragment: DNA-sekvensering (Sanger et al. 1977), utfylling av 5 ‘overheng og fjerning av 3’ overheng for å danne stumpe ender (Sambrook 1989), og andre trådsyntese i mutagenese (Gubler 1987)