Taq polymerase een van de meest alomtegenwoordige enzymen in de moleculaire biologie. Sinds zijn ontdekking in 19651, is Taq de ruggengraat van PCR en alle downstreamtoepassingen geworden die technologie toelaat. Deze krachtige polymerase is de standaardkeuze voor de meeste amplificatie en het klonen procedures, evenals kenmerkende tests, het rangschikken van het markergendna, en nog veel meer.

wat maakt Taq polymerase zo speciaal? In het artikel van vandaag, zullen wij een blik op de voor-en nadelen van Taq nemen, wat u nodig hebt om de beste PCR resultaten van Taq polymerase, en sommige Taq derivaten die u kunnen helpen betere resultaten voor gespecialiseerde toepassingen te bereiken.

Waarom wordt Taq zo veel gebruikt voor PCR?de populariteit van Taq is te danken aan het feit dat het de eerste polymerase op hoge temperatuur was die door moleculair biologen werd ontdekt. Maar, dat is verre van de enige reden dat het nog steeds in zo ‘ n hoge vraag vandaag.

Taq-polymerase heeft het belangrijke kenmerk dat het stabiel is bij temperaturen tot 95 ° C2. Dat is cruciaal omdat dit de temperatuur is waarbij DNA-denaturen-een vereiste stap aan het begin van de PCR-reactie. Terwijl om het even welke gematigde temperatuurpolymerase ook bij die temperatuur zou denatureren, die het onbruikbaar maakt, blijft Taq perfect klaar om uw doeldnamonster te polymeriseren.bovendien heeft Taq het voordeel dat hij het meest actief is in het temperatuurbereik van 70-80°C2. Dat is heet genoeg dat DNA niet zal herlinnen, maar primers die bij lagere temperaturen zijn uitgegloeid, zullen er ook niet afpellen. Zo, Taq polymerase werkt uiterst goed bij de temperaturen de meeste standaard PCR reacties vereisen.

ten slotte is Taq geschikt voor de elementaire moleculaire biologie die zeer goed nodig is. De polymerase laat a-tailed producten, die gemakkelijk kunnen worden gekloond in een vector met behulp van een standaard TA klonen kit. Taq is ook relatief veerkrachtig voor DNA-sequenties met een brede waaier van GC-inhoud en is niet zo kieskeurig over doeldna-of dNTP-concentraties.

wat heeft Taq nodig om effectief te polymeriseren?

Als u alleen Taq-polymerase aan een DNA-monster toevoegt, gebeurt er niet veel. Dat komt omdat, zoals de meeste enzymen, Taq een gespecialiseerde mix van reagentia nodig heeft om goed te werken.

De Basistaq-buffer omvat kaliumchloride, Tris-hydrochloride en Triton X-100. Deze chemicaliën zijn minder relevant voor het optimaliseren van uw PCR – reacties dan voor het veilig houden van Taq tijdens opslag in de vriezer-wat zelf belangrijk is om het meeste uit uw PCR ‘ s te halen. Terwijl u uw eigen buffer kunt maken om gevriesdroogd Taq-enzym te rehydrateren en op te slaan, wordt de overgrote meerderheid van polymerase verkocht als een Mastermix met Taq die al in de vereiste bufferoplossing is gesuspendeerd.

kritischer voor uw PCR-reacties is magnesiumchloride. Magnesium is een essentiële cofactor voor Taq polymerase3. Zonder het, zal Taq niet in staat zijn om de toevoeging van nucleotiden aan de inleiding of de groeiende bundel van DNA te katalyseren. De concentratie van magnesium is ook van belang. Naarmate meer magnesium wordt toegevoegd aan een PCR-reactie, wordt Taq actiever, maar ook minder specifiek in het polymeriseren van alleen de DNA-bundel van uw doel.

vanwege de concentratie-afhankelijke rol van magnesium, kunt u Taq master mixen met magnesium al opgenomen evenals mixen die het weglaten. In het laatste geval dient u magnesiumchloride apart toe te voegen (wat een extra pipetteerstap vereist bij het voorbereiden van uw PCR ‘ s). Het voordeel is dat u de exacte concentratie van magnesium kunt controleren, zodat u kunt experimenteren om de meest optimale mix van Taq productiviteit en specificiteit te vinden.

Wat zijn de problemen met Taq-Polymerase?

Taq wordt veel gebruikt voor routine PCR ‘ s, maar helaas is het niet perfect voor alle toepassingen. Het meest opmerkelijke nadeel van Taq is dat het niet de meest nauwkeurige polymerase die er zijn. Taq heeft een foutenpercentage van ongeveer één fout per 100.000 basisparen4. Ter vergelijking, Pfu proofreading polymerase is ongeveer 10 keer nauwkeuriger. Als u PCR vóór het klonen of het rangschikken van DNA gebruikt, kan dat verschil in foutenpercentage zeer significant zijn.

standaard Taq-polymerase kan ook problemen hebben met het versterken van DNA-sequenties die langer zijn dan ongeveer 1 kB. In vergelijking met andere soorten polymerasen, Taq heeft een lage processiviteit, wat betekent dat de efficiëntie aanzienlijk afneemt met de lengte van uw amplicon. Deze lage processiviteit kan worden verergerd door de aanwezigheid van PCR-remmers, die gebruikelijk zijn als je werkt met DNA uit weefsels, planten of grond.

tot slot, terwijl Taq-polymerase het meest efficiënt is bij temperaturen boven 70°C, blijft het enzym werken bij temperaturen onder 50°C. Dat is problematisch omdat Taq onbedoeld primers of DNA-sequenties van niet-doelsoorten kan polymeriseren wanneer de temperatuur in uw PCR-reactie daalt zodat primers aan uw doelsequentie kunnen ontharden. Dientengevolge, is Taq gekend om primer dimeren en andere ongewenste producten te produceren die in de weg van downstreamtoepassingen zoals het klonen kunnen krijgen.

gespecialiseerde Taq-polymerasen voor geavanceerde toepassingen

gelukkig zijn er gespecialiseerde vormen van Taq-polymerase die sommige van deze problemen oplossen. Bijvoorbeeld, highqu ALLin Taq polymerase is een synthetische versie van Taq die meer processiviteit dan standaard Taq heeft. Hierdoor kunt u gemakkelijker ampliconrendementen bereiken van sjablonen met een hoge GC-waarde, sjablonen met een lengte van meer dan 1 kB en monsters met matige concentraties van remmers.

een andere veel voorkomende vorm van Taq, zoals de Allin Hot Start Taq, is ontworpen met een moleculaire remmer om het inactief te maken bij lagere temperaturen. Warmstart Taq is alleen functioneel na verhitting tot 95°C. dat vermindert de vorming van primer dimeren en niet-specifieke ampliconen als gevolg van polymerisatie voor het begin van uw PCR reacties dramatisch. Als gevolg hiervan kunt u hogere opbrengsten krijgen bij het werken met langere doelsequenties en bezuinigen op achtergrondamplicons die normaal gesproken opschonen vereisen.

conclusie

Taq-polymerase is al lang het enzym bij uitstek voor zowel routinematige als complexe PCR-toepassingen. Het past perfect aan de vereisten van de PCR-reactie, terwijl het maken van downstreamtoepassingen zoals het klonen en het rangschikken eenvoudig. Hoewel standaard Taq sommige nadelen heeft, worden deze grotendeels opgelost door een ontworpen of hete polymerase van starttaq te gebruiken. Voor de overgrote meerderheid van toepassingen, blijft de polymerase Taq het go-to enzym voor moleculaire biologen.

1 Ishino s, Ishino Y. 2014. Grenzen in microbiologie 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostic Molecular Pathology: A Guide to Applied Molecular Testing.

3 Williams M. 2018. Sciencing

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.