I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
Enzymatische Reacties: (afbeeldingen wordt geopend in een nieuw venster)

• Polymerisatie
• Proeflezen
• Primer Verwijderen

DNA-polymerase I participeert in de DNA-replicatie van prokaryoten. De kettinggroei van DNA is in de richting 5′ aan 3 ‘met toevoeging aan het 3’ hydroxyl eind. De nieuwe ketting is base-gekoppeld met de sjabloon, en de nieuwe ketting en sjabloon zijn antiparallel. De polymerase I van DNA is de overvloedigste polymerase en functies om hiaten in DNA te vullen die zich tijdens de replicatie, de reparatie, en de nieuwe combinatie van DNA voordoen.

geschiedenis:

DNA-polymerase I werd ontdekt door Arthur Kornberg et al. in 1956. Zijn eerste resultaten werden voor het eerst gepresenteerd op de jaarlijkse bijeenkomst van de Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) in 1956 in Atlantic City, New Jersey. Recensenten van zijn eerste paper suggereerden dat de auteurs verwijzen naar het product als ‘polydeoxyribonucleotide’ in plaats van ‘DNA’; ‘DNA’ werd pas goedgekeurd na een beroep op hoofdredacteur John Edsall (Friedberg 2006). Nog twee papers werden gepubliceerd in 1958 door Lehman et al. en Bessman et al., die definitief vastgestelde polymerase van DNA replicatie uitvoerde. Kornberg kreeg de Nobelprijs in 1959 voor zijn ontdekking van DNA-polymerase I. in 1969, Jovin et al. verhelderde de aminozuursamenstelling (Jovin et al. 1969a, b). In datzelfde jaar isoleerde DeLucia en Cairns een E. coli stam met een mutatie die de DNA polymerase beà nvloed en verrassend gevonden dat de mutant synthetiseerde DNA normaal. Deze ontdekking deed twijfels rijzen over de rol van de polymerase van DNA in replicatie en leidde tot groepen om naar andere replicatie enzymen te zoeken. Tegelijkertijd toonden Klenow en collega ‘ s aan dat de behandeling van DNA-polymerase met het proteolytische enzym subtilisine (Type Carlsberg) resulteerde in een toename van de polymeraseactiviteit en een afname van de exonuclease-activiteit. De resulterende polymerase van DNA werd geà soleerd en werd genoemd het “fragment van Klenow” (Klenow en Henningsen 1970a, en klenow en Overgaard-Hansen 1970). in 1970 werd DNA-polymerase II van E. coli geïsoleerd en gekarakteriseerd door Arthur Kornberg ‘ s zoon, Thomas Kornberg (Kornberg en Gefter 1970). DNA-polymerase II werd ook onafhankelijk gerapporteerd door Knippers en door Moses en Richardson in 1970 (Moses en Richardson 1970b). Een jaar later, identificeerden Thomas Kornberg en Gefter de polymerase III van DNA (Kornberg en Gefter 1971).

Recent onderzoek met DNA-polymerase I omvatte onderzoek naar de moleculaire basis van substraatspecificiteit door middel van thermodynamische studies (Wowor et al. 2010) en single-molecule FRET experimenten (Santoso et al. 2010). Hastings et al. hebben de interacties van de vijf E. coli DNA polymerases tijdens cellulaire stress onderzocht (Hastings et al. 2010), en Kukreti et al.de studies hebben tot doel om te bepalen welke residuen belangrijk zijn voor 3′ -5 ‘ exonucleaseactiviteit (Kukreti et al. 2008).

specificiteit:

DNA-synthese vereist een primerstreng met een vrij 3 ‘ – hydroxyl terminus die aan een DNA-sjabloonstreng is gegloeid en de deoxynucleotidetrifosfaten vormen basenparen met de sjabloon. De toevoeging is in de 5 ’tot 3′ richting met vrijgave van pyrofosfaat. Het enzym is actief met DNAs die enige vastgelopen hiaten bevatten en ook met DNAs met enig-streng onderbrekingen of inkepingen. Onder sommige voorwaarden, kunnen de hybriden van RNA-DNA en een duplex van RNA als malplaatje-inleiding dienen (Setlow 1972).

de 5′ tot 3 ‘- exonucleaseactiviteit geassocieerd met DNA-polymerase I degradeert zowel enkelstrengs als dubbelstrengs DNA in de 5′ tot 3′ – richting, wat 5’ – mononucleotiden oplevert. De 5 ‘Aan 3′ exonucleaseactiviteit is specifiek voor dubbel vastgelopen DNA, die 5’-mononucleotides en oligonucleotides opleveren. DNA-polymerase I kan ook mismatched gebieden in DNA uitsnijden (Setlow 1972).

de vergelijkbare structuur van DNA-polymerasen heeft aangetoond dat de meeste DNA-polymeraseenzymen een identiek twee metaalion-gekatalyseerd polymerasemechanisme gebruiken. Een metaalion activeert de primer ’s 3′ – OH voor aanval op het A-Fosfaat van de dNTP. Het andere metaalion stabiliseert de negatieve lading van de verlatende zuurstof en cheleert de B-en g-fosfaten (Steitz 1999).

Het klenow-fragment is een proteolytisch product van E. coli DNA-polymerase I dat polymerisatie en 3′ tot 5′ exonucleaseactiviteit behoudt, maar 5′ tot 3′ exonucleaseactiviteit heeft verloren.

samenstelling:

DNA-polymerase I is het overheersende polymeriserend enzym dat wordt aangetroffen in E. coli. Het bevat één disulfidebinding en één sulfhydrylgroep (Jovin et al. 1969b). Vijf verschillende polymerases van DNA zijn geà soleerd van E. coli en zijn aangewezen I, II, III, IV, en V. de polymerase I functies van DNA om hiaten van DNA te vullen die zich tijdens de replicatie, de reparatie, en de nieuwe combinatie van DNA voordoen. De polymerase II van DNA functioneert ook in het uitgeven en het proeflezen hoofdzakelijk in de achterblijvende bundel (Kim et al. 1997, Wagner en Nohmi 2000). De polymerase III van DNA is het belangrijkste replicatieve enzym. De polymerase IV en V van DNA hebben grote actieve plaatsen die voor meer basismisincorporation toestaan, en daarom meer fout-naar voren gebogen zijn. Ze missen ook proeflezen-exonuclease subunits om misincorporaties te corrigeren (Nohmi 2006, and Hastings et al. 2010). De polymerase V van DNA is aanwezig op significante niveaus slechts in SOS-veroorzaakte cellen en de overexpressie beperkt de synthese van DNA (Marsh en Walker 1985).

De domeinvorm van alle polymerasen waarvan de structuren bekend zijn, is beschreven als een “rechterhand” met “duim”, “palm” en “vinger” domeinen (Kohlstaedt et al. 1992). Het palmgebied wordt verondersteld om de phosphoryloverdracht te katalyseren, en het vingergebied wordt verondersteld om met het inkomende nucleosidetrifosfaat en de malplaatjebasis in wisselwerking te staan het wordt in paren gerangschikt aan. Men denkt dat de duim helpt bij de positionering van het DNA en bij de translocatie (Brautigam en Steitz 1998).

moleculaire eigenschappen:

het gen dat codeert voor DNA-polymerase I (polA) bevat ongeveer 3000 basenparen en codeert voor ongeveer 1000 aminozuurresiduen in een eenvoudige polypeptideketen. Zelfs organismen gescheiden door een miljard jaar evolutie (zoals Deinococcus-Thermus genera en E. coli) hebben ongeveer 35% aminozuuridentiteit en ongeveer 50% homologie (Patel et al. 2001).

Eiwittoetredingsnummer: P00582

molecuulgewicht:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Klenow fragment: 70 kDa (gel filtration, Klenow and Overgaard-Hansen 1970)

optimale pH:

• maximale activiteit wordt verkregen bij pH 7,4 met kaliumfosfaatbuffer voor native DNA of poly dAT template-primer systems (Richardson et al. 1964)
• Klenow-fragment: maximale activiteiten worden verkregen bij 7,4 met fosfaatbuffer en bij 8.4 met Tris-HCl buffer

iso-elektrisch punt:

• 5,40 (theoretisch)

Extinctiecoëfficiënt:

activatoren:

• een divalent kation is vereist voor activiteit
• Mg2+ bij een concentratie van 7 mM levert optimale activiteit onder de omstandigheden van de standaardtest (Richardson et al. 1964)
• Mn2+ kan gedeeltelijk voldoen aan de eis van metaalionen
• enzymactiviteit wordt ook beïnvloed door concentraties van monovalente kationen zoals K+, Rb+, Cs+ en NH4 +

remmers:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• hoog percentage opname van radioactiviteit voor nick translation assays
• standaard referentiemateriaal voor de studie van DNA-polymerasen
• vervaardiging van afwisselende copolymeren zoals poly d (A-T) en homopolymeren zoals poly dG-poly dC
• Klenow fragment: DNA sequencing (sanger et al. 1977), invullen van 5 ‘overhangen en verwijderen van 3’ overhangen om botte uiteinden te vormen (Sambrook 1989), en tweede bundelsynthese in mutagenese (Gubler 1987)