I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
reakcje enzymatyczne: (obrazy zostaną otwarte w nowym oknie)

• polimeryzacja
• korekta
• usuwanie podkładu

polimeraza DNA i replikacja DNA prokariotów. Wzrost łańcucha DNA przebiega w kierunku 5′ do 3′ z dodatkiem na końcu hydroksylowym 3′. Nowy łańcuch jest sparowany z szablonem, a nowy łańcuch i szablon są antyrównoległe. Polimeraza DNA I jest najbardziej obfite polimerazy i funkcje do wypełnienia luk w DNA, które powstają podczas replikacji DNA, naprawy i rekombinacji.

Historia:

polimeraza DNA i została odkryta przez Arthura Kornberga i wsp. w 1956 roku. Jego wstępne wyniki zostały po raz pierwszy przedstawione na dorocznym spotkaniu Federacji amerykańskich Towarzystw Biologii Doświadczalnej (FASEB) w Atlantic City w stanie New Jersey w 1956 roku. Recenzenci pierwszej pracy zasugerowali, że autorzy odnoszą się do produktu jako „polideoksyrybonukleotyd”, a nie „DNA”; „DNA” zostało zatwierdzone dopiero po odwołaniu się do redaktora naczelnego, Johna Edsalla (Friedberg 2006). Kolejne dwie prace zostały opublikowane w 1958 roku przez Lehman et al. i Bessman et al., co ostatecznie ustaliło, że polimeraza DNA przeprowadzała replikację DNA. Kornberg otrzymał Nagrodę Nobla w 1959 roku za odkrycie polimerazy DNA I.

w 1969 roku Jovin i wsp. wyjaśniono skład aminokwasów (Jovin i wsp. 1969a, b). W tym samym roku DeLucia i Cairns wyizolowali E. szczep coli z mutacją, która wpłynęła na polimerazę DNA i zaskakująco okazało się, że mutant syntetyzuje DNA normalnie. Odkrycie to rzuciło wątpliwości co do roli polimerazy DNA w replikacji i skłoniło grupy do poszukiwania innych enzymów replikacyjnych. Jednocześnie Klenow i współpracownicy wykazali, że leczenie polimerazy DNA enzymem proteolitycznym subtylizyny (Typ Carlsberg) spowodowało wzrost aktywności polimerazy i zmniejszenie aktywności egzonukleazy. Otrzymaną polimerazę DNA wyizolowano i nazwano „fragmentem Klenowa” (Klenow and Henningsen 1970a oraz Klenow and Overgaard-Hansen 1970).

w 1970 r.wyizolowano i scharakteryzowano polimerazę DNA II E. coli przez syna Arthura Kornberga, Thomasa Kornberga (Kornberg and Gefter 1970). Polimeraza DNA II została również niezależnie opisana przez Knipersa oraz przez Mosesa i Richardsona w 1970 roku (Moses and Richardson 1970b). Rok później Thomas Kornberg i Gefter zidentyfikowali polimerazę DNA III (Kornberg and Gefter 1971).

ostatnie prace z polimerazą DNA i obejmowały badanie molekularnych podstaw specyficzności substratu poprzez badania termodynamiczne (wowor et al. 2010) i jednocząsteczkowe eksperymenty FRET (Santoso et al. 2010). Hastings et al. zbadali interakcje pięciu polimeraz DNA E. coli podczas stresu komórkowego (Hastings et al. 2010) oraz Kukreti et al.badania miały na celu określenie, które pozostałości są ważne dla aktywności egzonukleazy 3 ’ -5 '(Kukreti et al. 2008).

specyfika:

synteza DNA wymaga nici starterowej z wolnym końcem 3′-hydroksylowym wyżarzonym do nici szablonu DNA, a trifosforany deoksynukleotydowe tworzą pary zasad z szablonem. Dodawanie odbywa się w kierunku 5′ do 3′ z uwalnianiem pirofosforanu. Enzym jest aktywny z DNAs zawierającymi szczeliny jednoniciowe, a także z DNAs z przerwami jednoniciowymi lub nićmi. W pewnych warunkach hybrydy RNA-DNA i dupleks RNA mogą służyć jako starter szablonowy (Setlow 1972).

aktywność egzonukleazy 5′ do 3′ związana z polimerazą DNA i degraduje jedno-i dwuniciowe DNA w kierunku 5′ do 3′, dając 5′ – mononukleotydy. Aktywność egzonukleazy 5 'do 3′ jest specyficzna dla dwuniciowego DNA, dając 5 ’ – mononukleotydy i oligonukleotydy. Polimeraza DNA i może również akcyzy niedopasowanych regionów w DNA (Setlow 1972).

podobna struktura polimeraz DNA wskazuje, że większość enzymów polimerazy DNA wykorzystuje identyczny mechanizm polimerazy katalizowany jonami metali. Jeden jon metalu aktywuje 3′-OH startera do ataku na fosforan a dNTP. Drugi jon metalu stabilizuje ładunek ujemny opuszczającego tlenu i chelatuje fosforany b I G (Steitz 1999).

fragment Klenowa jest produktem proteolitycznym polimerazy DNA E. coli I, która zachowuje polimeryzację i aktywność egzonukleazy 3′ do 5′, ale traci aktywność egzonukleazy 5′ do 3′.

skład:

polimeraza DNA i jest dominującym enzymem polimeryzującym występującym w E. coli. Zawiera jedno wiązanie dwusiarczkowe i jedną grupę sulfhydrylową (Jovin i wsp. 1969b). Pięć różnych polimeraz DNA wyizolowano z E. coli i oznaczono I, II, III, IV i V. Funkcje polimerazy DNA i wypełniają luki DNA, które powstają podczas replikacji, naprawy i rekombinacji DNA. Polimeraza DNA II działa również w edycji i korekty głównie w nici opóźnionej (Kim et al. 1997, Wagner i Nohmi 2000). Polimeraza DNA III jest głównym enzymem replikacyjnym. Polimeraza DNA IV i V mają duże aktywne miejsca, które pozwalają na większą misincorporation bazy, a zatem są bardziej podatne na błędy. Brakuje im również podjednostek egzonukleazowych do korekty błędnych konsekwencji (Nohmi 2006, and Hastings et al. 2010). Polimeraza DNA V jest obecna na znaczących poziomach tylko w komórkach wywołanych SOS, a nadmierna ekspresja ogranicza syntezę DNA (Marsh and Walker 1985).

kształt domeny wszystkich polimeraz, których struktury są znane, został opisany jako „prawa ręka” z domenami „kciuk”, „dłoń” i „palec” (Kohlstaedt et al. 1992). Uważa się, że region palmy katalizuje przeniesienie fosforylu, a region palca oddziałuje z przychodzącym trifosforanem nukleozydu i bazą szablonu, z którą jest sparowany. Uważa się, że kciuk pomaga w pozycjonowaniu DNA i translokacji (Brautigam and Steitz 1998).

charakterystyka molekularna:

gen kodujący polimerazę DNA i (polA) zawiera około 3000 par zasad i koduje około 1000 reszt aminokwasowych w prostym łańcuchu polipeptydowym. Nawet organizmy oddzielone miliardami lat ewolucji (np. Deinococcus-Thermus genera i E. coli) mają około 35% identyczności aminokwasowej i około 50% homologii (Patel i wsp. 2001).

numer akcesyjny białka: P00582

Masa cząsteczkowa:

• 109 kDa (Jovin i in. 1969a, b)
• fragment Klenowa: 70 kDa (filtracja żelowa, Klenow i Overgaard-Hansen 1970)

optymalne pH:

• maksymalną aktywność uzyskuje się przy pH 7,4 z buforem fosforanowym potasu dla natywnych systemów DNA lub poli dat template-primer (Richardson et al. 1964)
• fragment Klenowa: maksymalne działanie uzyskuje się przy 7,4 z buforem fosforanowym i przy 8.4 z buforem Tris-HCl

Punkt izoelektryczny:

• 5,40 (teoretyczny)

Współczynnik ekstynkcji:

aktywatory:

• dla aktywności
• Mg2+ przy stężeniu 7 mM daje optymalną aktywność w Warunkach standardowego testu (Richardson i in. 1964)
• Mn2 + może częściowo spełnić wymóg jonów metali
• aktywność enzymu ma również wpływ na stężenia kationów monowalentnych, takich jak K+, RB+, Cs+ i NH4 +

inhibitory:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• wysoka procentowa inkorporacja radioaktywności do testów translacji Nicka
• Standardowy materiał odniesienia do badania polimeraz DNA
• wytwarzanie naprzemiennych kopolimerów, takich jak Poli D(A-T) i homopolimerów, takich jak poli dG-poli dC
• fragment Klenowa: sekwencjonowanie DNA (Sanger et al. 1977), wypełnienie 5 'nawisów i usunięcie 3′ nawisów w celu utworzenia tępych końców (Sambrook 1989) oraz synteza drugiej nici w mutagenezie (Gubler 1987)