polimeraza Taq jest jednym z najbardziej wszechobecnych enzymów w biologii molekularnej. Od czasu odkrycia w 1965 r. 1 Taq stała się podstawą PCR i wszystkich zastosowań niższego szczebla, które umożliwia technologia. Ta potężna polimeraza jest domyślnym wyborem dla większości procedur amplifikacji i klonowania,a także testów diagnostycznych, sekwencjonowania DNA genów markerowych i wielu innych.

co czyni polimerazę Taq tak wyjątkową? W dzisiejszym artykule przyjrzymy się zaletom i wadom Taq, czego potrzebujesz, aby uzyskać najlepsze wyniki PCR z polimerazy Taq i niektóre pochodne Taq, które mogą pomóc w osiągnięciu lepszych wyników dla specjalistycznych zastosowań.

dlaczego Taq jest tak szeroko stosowany do PCR?

popularność Taq wynika z faktu, że była to pierwsza wysokotemperaturowa polimeraza odkryta przez biologów molekularnych. Ale to nie jedyny powód, dla którego wciąż jest tak duże zapotrzebowanie.

polimeraza Taq ma ważną cechę stabilności w temperaturach do 95°C2. Jest to krytyczne, ponieważ jest to temperatura, w której denaturacja DNA-wymagany etap na początku reakcji PCR. Podczas gdy każda polimeraza o umiarkowanej temperaturze również uległaby denaturacji w tej temperaturze, czyniąc ją bezużyteczną, Taq pozostaje doskonale gotowa do rozpoczęcia polimeryzacji docelowej próbki DNA.

ponadto Taq ma tę zaletę, że jest najbardziej aktywny w zakresie temperatur 70-80°C2. Jest na tyle gorące, że DNA nie ulegnie regeneracji, ale startery, które wyżarzały się w niższych temperaturach, również się nie odkleją. Tak więc polimeraza Taq działa bardzo dobrze w temperaturach, których wymaga większość standardowych reakcji PCR.

wreszcie Taq odpowiada podstawowym potrzebom biologii molekularnej. Polimeraza pozostawia produkty a-tailed, które można łatwo sklonować do wektora za pomocą standardowego zestawu do klonowania TA. Taq jest również stosunkowo odporny na sekwencje DNA z szerokim zakresem zawartości GC i nie jest tak wybredny w odniesieniu do docelowych stężeń dna lub dNTP.

czego Taq potrzebuje, aby skutecznie polimeryzować?

Jeśli po prostu dodasz polimerazę Taq na własną rękę do próbki DNA, niewiele by się wydarzyło. Dzieje się tak dlatego, że jak większość enzymów, Taq potrzebuje specjalistycznej mieszanki odczynników do prawidłowego działania.

podstawowy bufor Taq obejmuje chlorek potasu, chlorowodorek Tris i Triton X-100. Te chemikalia są mniej istotne dla optymalizacji reakcji PCR niż dla zapewnienia bezpieczeństwa Taq podczas przechowywania w zamrażarce-co samo w sobie jest ważne w maksymalnym wykorzystaniu PCR. Podczas gdy można stworzyć własny bufor do nawodnienia i przechowywania liofilizowanego enzymu Taq, zdecydowana większość polimerazy jest sprzedawana jako mieszanka główna z Taq już zawieszona w wymaganym roztworze buforowym.

bardziej krytyczny dla reakcji PCR jest chlorek magnezu. Magnez jest niezbędnym kofaktorem polimerazy Taq3. Bez niego Taq nie będzie w stanie katalizować dodawania nukleotydów do startera lub rosnącej nici DNA. Znaczenie ma również stężenie magnezu. Gdy więcej magnezu jest dodawane do reakcji PCR, Taq staje się bardziej aktywny, ale także mniej specyficzny w polimeryzacji tylko docelowej nici DNA.

ze względu na zależną od stężenia rolę magnezu, można znaleźć mieszanki Taq master z już zawartym magnezem, a także mieszanki, które go pomijają. W tym drugim przypadku należy dodać oddzielnie chlorek magnezu (co wymaga dodatkowego etapu pipetowania podczas przygotowywania PCRs). Zaletą jest to, że możesz kontrolować dokładne stężenie magnezu, dzięki czemu możesz eksperymentować, aby znaleźć najbardziej optymalną mieszankę produktywności i specyficzności Taq.

jakie są problemy z polimerazą Taq?

Taq jest szeroko stosowany do rutynowych PCR, ale niestety nie jest idealny do wszystkich zastosowań. Najbardziej zauważalną wadą Taq jest to, że nie jest to najdokładniejsza polimeraza. Współczynnik błędu Taq wynosi około jednego błędu na 100 000 par bazowych4. Dla porównania, korekta Pfu jest około 10 razy dokładniejsza. Jeśli używasz PCR przed klonowaniem lub sekwencjonowaniem DNA, ta różnica w stopie błędu może być bardzo znacząca.

Standardowa polimeraza Taq może mieć również problemy z amplifikacją docelowych sekwencji DNA dłuższych niż około 1 kB. W porównaniu z innymi rodzajami polimeraz Taq ma niską procesywność, co oznacza, że jego wydajność znacznie spada wraz z długością amplikonu. Ta niska procesywność może być pogorszona przez obecność inhibitorów PCR, które są powszechne, jeśli pracujesz z DNA wyekstrahowanym z tkanek, roślin lub gleby.

wreszcie, podczas gdy polimeraza Taq jest najbardziej wydajna w temperaturach powyżej 70°C, enzym nadal działa w temperaturach poniżej 50°C. Jest to problematyczne, ponieważ Taq może przypadkowo polimeryzować startery lub sekwencje DNA niebędące celem, gdy temperatura w reakcji PCR spada, aby umożliwić starterom wyżarzanie się do docelowej sekwencji. W rezultacie Taq jest znane z produkcji dimerów podkładu i innych niechcianych produktów, które mogą przeszkadzać w dalszych zastosowaniach, takich jak klonowanie.

specjalistyczne polimerazy Taq do zaawansowanych zastosowań

na szczęście istnieją wyspecjalizowane formy polimerazy Taq, które rozwiązują niektóre z tych problemów. Na przykład polimeraza taq allin highQu jest syntetyczną wersją Taq, która ma większą procesywność niż standardowa Taq. W rezultacie można łatwiej uzyskać wydajność amplikonu z szablonów o wysokiej GC, szablonów o długości powyżej 1 kB i próbek o umiarkowanym stężeniu inhibitorów.

inną popularną formą Taq, jak Allin Hot Start Taq, jest zaprojektowany z inhibitorem molekularnym, aby uczynić go nieaktywnym w niższych temperaturach. Hot start Taq działa dopiero po podgrzaniu do temperatury 95°C. to znacznie zmniejsza tworzenie się dimerów startera i niespecyficznych amplikonów w wyniku polimeryzacji przed rozpoczęciem reakcji PCR. W rezultacie można uzyskać wyższą wydajność podczas pracy z dłuższymi sekwencjami docelowymi i ograniczyć amplikony tła, które normalnie wymagają czyszczenia.

wniosek

polimeraza Taq od dawna jest enzymem z wyboru zarówno do rutynowych, jak i złożonych zastosowań PCR. Doskonale spełnia wymagania reakcji PCR, jednocześnie ułatwiając późniejsze aplikacje, takie jak klonowanie i sekwencjonowanie. Chociaż standardowe Taq ma pewne wady, są one w dużej mierze rozwiązane za pomocą inżynierii lub hot start polimerazy Taq. W zdecydowanej większości zastosowań polimeraza Taq pozostaje enzymem got – to dla biologów molekularnych.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Frontiers in Microbiology 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostic Molecular Pathology: A Guide to Applied Molecular Testing.

3 Williams M. 2018.

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.