opis testu

MLH1 koduje eksony 1-19, msh2 koduje eksony 1-16, msh6 koduje eksony 1-10, a PMS2 koduje eksony 1-15, a także do 5′ I 3′ końców wszystkich intronów i nieprzetłumaczonych regionów są analizowane przez sekwencjonowanie. Całkowita analiza delecji / duplikacji określa liczbę kopii genu dla wszystkich kodujących eksonów MLH1, MSH2, msh6 i PMS2 oraz kodujących ekson 9 EPCAM. Inwersja kodujących eksonów 1-7 genu msh2 jest wykrywana przez NGS i potwierdzana przez PCR i elektroforezę w żelu agarozowym. Zawsze podaje się istotne klinicznie zmiany wewnątrzgałkowe przekraczające 5 par zasad. Warianty introniczne o nieznanym lub mało prawdopodobnym znaczeniu klinicznym nie są zgłaszane poza 5 parami zasad od złącza splice. Genomowy kwas deoksyrybonukleinowy (gDNA) jest izolowany z próbki pacjenta za pomocą znormalizowanej metodologii i oznaczany ilościowo. Wzbogacanie sekwencji ukierunkowanych egzonów kodujących i sąsiednich nukleotydów intronicznych przeprowadza się metodą chwytania przynęty, przy użyciu długich sond biotynylowanych oligonukleotydowych, a następnie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Sekwencjonowanie Sangera jest wykonywane dla wszelkich regionów brakujących lub z niewystarczającym zasięgiem głębokości odczytu dla wiarygodnego wykrywania wariantu heterozygotycznego. Warianty potencjalnie homozygotyczne, warianty w regionach skomplikowanych przez interferencję pseudogenową oraz wywołania wariantowe niespełniające głębokości zasięgu i progi jakości częstotliwości alleli wariantowych są weryfikowane przez sekwencjonowanie Sangera. Przeprowadzana jest również analiza delecji/duplikacji MLH1, MSH2, MSH6 i PMS2 z wykorzystaniem głębokości odczytu z danych NGS oraz EPCAM z wykorzystaniem amplifikacji sondy zależnej od ligacji multipleksowej (MLPA). Wszelkie zmiany liczby kopii wykryte przez NGS są potwierdzane przez ukierunkowaną mikromacierz chromosomowy i / lub MLPA. W przypadku wykrycia delecji w eksonach 13, 14 lub 15 PMS2, przeprowadzone zostanie dwuniciowe sekwencjonowanie odpowiedniego eksonu(eksonów) pseudogenu, PMS2CL, w celu ustalenia, czy delecja znajduje się w genie PMS2 lub pseudogenie. W przypadku wykrycia delecji w eksonie 9 EPCAM, zostanie przeprowadzona analiza delecji/duplikacji kodujących eksonów 3 i 8 EPCAM. W przypadku EPCAM zgłaszane są jedynie delecje brutto obejmujące 3 ’ koniec genu.