analiza cinetică linia Weaver-BURK ecuația complot dublu reciproc al cineticii enzimatice

8.3. Ecuația Lineweaver-Burk (complot dublu reciproc):

în 1934, Lineweaver și Burk au făcut o simplă modificare matematică în ecuația lui Michalies –Menten prin trasarea unei inverse duble a concentrației substratului și a vitezei de reacție.

linia Weaver Burk parcela este obținută prin luarea reciprocă a ambelor părți ale ecuației michalies–Menteris (MME).

în linia weaver Burk (LB) complot ecuația Michaelis Menten este transformată în curbă linie dreaptă.

este folosit pentru a estima Vmax din poziția de interceptare pe axa X.

• linia dreaptă este dată de Y = MX + C, unde C Este y interceptarea regresiei lui Y pe X și M este panta.
• dacă valoarea M crește, atunci panta crește.
• dacă facem valoarea Vmax egală cu constantă, atunci valoarea Km este mare și dacă valoarea Km este constantă, valoarea Vmax scade.

în această curbă hiperbolică devine o linie dreaptă și valoarea absolută a X-intercept a liniei este afinitatea (1 / Km) a enzimei pentru substrat. Interceptarea Y este 1 / Vmax. Panta liniei este Km / Vmax. Din nou, inițial acest lucru a fost făcut subiectiv. Este metoda mult mai fină pentru găsirea parametrilor cei mai potriviți pentru relația Michaelis-Menten netransformată.

aplicație

utilizarea parcelei Lineweaver–Burk pentru a determina Km și Vmax,. Interceptarea Y a unui astfel de grafic este echivalentă cu inversul Vmax; interceptarea X a graficului reprezintă -1/Km. Oferă o impresie vizuală rapidă a diferitelor forme de inhibare a enzimelor.

8.4. Diagrama Eadie–Hofstee

diagrama Eadie–Hofstee este o reprezentare grafică a cineticii enzimatice în care viteza de reacție este reprezentată în funcție de raportul dintre rata și concentrația substratului:

în această ecuație Michaelis Menten este reprezentată ca

inversați și înmulțiți cu Vmax :

aplicarea parcelei Eadie–Hofstee

identificarea rapidă a Km și Vmax

8.5. Hanes Woolf Plot

reprezentarea grafică a raportului dintre concentrația inițială a substratului și viteza de reacție V este reprezentată grafic în raport cu concentrația substratului .

ecuația Michaelis-Menten este derivată ca

Invertiți și înmulțiți cu :

Rearrange :

This equation will give straight line of slope a Y-intercept of and an X-intercept of –km

Application :-

Used for determination of Km, Vmax and Vmax/Km parameters

8.6. Inhibarea enzimei

enzimele sunt proteine care acționează ca un catalizator pentru reacții. Dar activitatea este inhibată sau blocată de moleculele care sunt substanțe chimice (organice / anorganice) în natură. Aceste molecule sau compuși se numesc inhibitori, iar procesul prin care inactivează enzima sau îi blochează activitatea se numește inhibare enzimatică.

inhibă activitatea catalitică enzimatică reversibil sau ireversibil prin modificarea lanțurilor laterale de aminoacizi necesare activității enzimatice.

în descoperirea medicamentelor, analogii medicamentelor sunt proiectați pentru detoxifierea multor antitoxine, deoarece au acțiune inhibitoare.

8.6.1. Reguli urmate de reacții de inhibare enzimatică

1. enzima se leagă cu substratul în raport 1 : 1 la locul activ într-un aranjament cu cheie de blocare sau potrivire indusă.
2. compușii inhibitori concurează cu substratul pentru situsul catalitic alosteric pe baza primului venit, pentru a face complexul substratului inhibitor enzimatic sau complexele inhibitorilor enzimatici.
3. enzima și substratul sau inhibitorii reacționează între ei într-un mod cinetic care este exprimat ca constante cinetice ale unei reacții catalitice.
4. condițiile fiziologice precum pH-ul, temperatura, concentrația substratului sau reactanților determină rata reacțiilor enzimatice.
5. forme intermoleculare între subunități enzimatice, interacțiuni de grup activ substrat sau inhibitor, proprietăți fizice de natură de legare: natură electrofilă, hidrofilă, nucleofilă și metaloprotienă; legarea hidrogenului afectează ratele globale de reacție enzimatică și modul de inhibare.

8.6.2. Tipuri de inhibiție enzimatică Inreversibilă

8.6.2.1. Inhibiție competitivă (reversibilă) : în acest caz, concurența prezentă între inhibitor și substrat pentru situsul activ.

situsul catalitic al enzimei este ocupat de inhibitor și activitatea sa este inhibată. Dar inhibarea este reversibilă. În acest caz, se formează atât substratul enzimatic, cât și complexul inhibitor enzimatic.

efect asupra afinității :- când concentrația inhibitorului crește afinitatea crește, dar afinitatea substratului scade și valoarea Km crește. Dar când concentrația substratului crește, atunci afinitatea sa crește și afinitatea inhibitorului scade și valoarea Km scade, adică.,

inhibitorul se leagă de situsurile active ale unei enzime, ceea ce înseamnă că inhibitorul concurează cu substratul pentru legarea la situsul activ, prin urmare, afinitatea substratului față de enzimă scade, prin urmare, valoarea Km crește. Noul km este dat de Km, unde

unde

i = concentrația inhibitorului

KDI = constanta de disociere a inhibitorului.

când concentrația inhibitorului crește, valoarea km crește pe măsură ce afinitatea substratului scade. Dacă constanta de disociere a este mai mare, complexul inhibitor enzimatic mai mult, a este mai mic, astfel km este mai mic. Valoarea lui a este egală cu 1 sau mai mare decât 1. Noua valoare a Km este aKm

efect asupra Vmax

Vmax se calculează la concentrația substratului infinit.

Vmax = Kcat

la o concentrație infinită de substrat, toate enzimele sunt sub forma complexului de substrat enzimatic I.e. Vmax is not affected.

Lineweaver Burk plot of competitive inhibition

8.6.2.2. Examples of Competitive Inhibitors

(a) Allopurinol :

Drug used for treatment of gout. Uric acid is formed in the body by oxidation of hypoxanthine by the enzyme xanthine oxidase. Allopurinol is structurally similar to hypoxanthine and inhibits the enzyme xanthine oxidase and reduced uric acid formation.

(B) metotrexat:

este un inhibitor competitiv al dihidrofolat reductazei (DHFR). Acest medicament este utilizat pentru terapia cancerului. Este similar din punct de vedere structural cu acidul folic, astfel, inhibă competitiv folatul reductază. Previne formarea hidrofolatului tetra. Prin urmare, sinteza ADN este suferită.

(c) inhibitori MAO (Mono amină oxidază):

Sunt, prima clasă de antidepresive care trebuie dezvoltate. Inhibitorii MAO cresc nivelul de serotonină dopamină prin inhibarea MAO. eg. Catecolamine (epinefrină și norepinefrine).

(d) Dicumarol:

acest medicament este similar cu vitamina K. warfarina medicamentului acționează ca un anticoagulant prin inhibarea competitivă a vitaminei K.

8.6.3. Inhibiție necompetitivă

nu există concurență între inhibitor și substrat, deoarece locurile de atașare ale substratului și inhibitorului sunt diferite. Inhibitorul nu are similitudine structurală cu substratul, prin urmare nu se poate lega de enzima liberă. Inhibitorii se leagă de complexul de substrat enzimatic care expune situsul de legare a inhibitorilor. Legarea inhibitorului poate provoca denaturarea situsului activ sau a situsului alosteric care inactivează cataliza.

efect asupra afinității:

afinitatea ridicată a inhibitorului înseamnă disocierea scăzută a complexului de substrat enzimatic la substratul enzimelor. În acest sens, inhibitorul se leagă de alt situs activ pe complexul de substrat enzimatic. Asta înseamnă că inhibitorul arată afinitate pentru complexul ES mai degrabă decât enzima. Astfel, în prezența inhibitorului, afinitatea enzimei față de substrat crește. Aceasta scade Km. Prin urmare

efect asupra Vmax

Vmax se calculează la o concentrație infinită de substrat. La o concentrație infinită de substrat, toate enzimele sunt sub formă de enzime complexe de substrat. Inhibitorul prezintă afinitate pentru complexul de substrat al enzimelor. Astfel, inhibitorul se leagă de complexul de substrat al enzimelor și împiedică cataliza complexului de substrat enzimatic în enzimă și produs. That’s why Vmax decreases and new Vmax is given by

Inhibitor concentration increases a value increases and Vmax decreases

On putting the values of new Km and new Vmax in lineweaver burk plot, The equation is as follows :-

Uncompetitive inhibitor causes different intercepts on both Y and X-axis but same slope.

8.6.4. Inhibiție mixtă (necompetitivă)

acest inhibitor nu este similar cu substratul structural, dar se poate lega atât de enzima liberă, cât și de complexul substat enzimatic.

când inhibitorul se leagă de enzimă departe de locurile active. Induce modificările conformaționale și reduce activitatea catalitică. Astfel, inhibitorii enzimatici și complexele inhibitoare ale substratului enzimatic devin neproductive. Concentrația substratului nu inversează reacția. Prin urmare, inhibarea duce la Km nealterat, dar Vmax redus.

lineweaver Burk plot este utilizat pentru a determina Km și Vmax în cinetica enzimatică. Interceptarea Y a unui astfel de grafic este echivalentă cu inversul Vmax, interceptarea X a graficului reprezintă inhibitori competitivi, prin urmare aceleași interceptări Y (deoarece Vmax nu este afectat de inhibitori competitivi), dar există pante diferite.

inhibitor necompetitiv produce complot cu aceeași x-intercept ca Km este neafectat, dar pante diferite cu Y-interceptează.

8.7. Cinetica reacției Multisubstrate

în cinetica enzimei, reacțiile simple implică legarea unui substrat de o enzimă și supunerea la reacții catalitice. Această condiție nu este comună. Majoritatea reacțiilor biochimice catalizate de două sau mai multe substraturi care iau parte la reacții. De exemplu, o enzimă E, a catalizat reacția care implică două substraturi a și B și produce produsul P și Q.

acest tip de reacție se numește reacție Bi-substrat . Aceste reacții se pot desfășura în două moduri:

8.7.1. Secvențial

ambele substraturi a și B, se leagă de enzima E, iar apoi reacțiile continuă să producă produse P și Q

acest tip de reacție se numește reacții secvențiale sau cu deplasare simplă, care sunt împărțite în următoarele grupuri.

legarea ordonată a substratului sau mecanismul secvențial ordonat – în acest tip, un substrat trebuie să se lege înainte de un al doilea substrat.

această reacție indică legarea secvențială a substraturilor, precum și eliberarea secvențială a produsului. Acest tip de mecanism este observat în reacțiile catalizate de lactat dehidrogenes care implică nad+ și lactat.

8.7.2. Legarea aleatorie a substratului – în acest tip, fie A, fie B se pot lega mai întâi de enzimă, urmată de celălalt substrat și eliberarea produsului.

This type of mechanism is observed in reactions catalyzed by transferases enzyme as hexokinase catalyzed phosphorylation of glucose by ATP.

8.7.3. Theorell-Chance Sequential mechanism

It is a type of ordered sequential bisubstrate reaction in which the ternary complex does not accumulate.

8.7.4. Mecanismul de Ping pong

cealaltă posibilitate în reacția bi-substrat este că un substrat, A, se leagă de enzimă și reacționează cu ea un produs, P, este eliberat și enzima se transformă într-o formă modificată, E’. Al doilea substrat, B, vine și se leagă cu enzima modificată pentru a produce al doilea produs, Q și a regenera enzima, E.

reacțiile care urmează mecanismului de mai sus se numesc reacții de Ping-Pong sau dublu-deplasare. Acest tip de mecanism este observat în reacțiile catalizate de aminotransferaze.

aceste enzime catalizează transferul unei grupări amino dintr-un aminoacid într-un acid-ceto-ceto.Produsele formate sunt un nou aminoacid corespunzător cetoacidului și un nou cetoacid corespunzător scheletului de carbon al aminoacidului, cum ar fi:-

un alt exemplu de reacție de ping pong este fosfoglicerat mutaza. Enzima obține fosfat dintr-un substrat și după fosforilarea enzimei, fosfatul este transferat în al doilea substrat.

NextPrevious