degenerarea discului este o afecțiune comună cu o etiologie multifactorială complexă. 1 infecția de grad scăzut a fost propusă ca o cauză a degenerării discului cu acnee Propionibacterium identificată la 84% dintre pacienții cu hernie de disc și sciatică folosind serologie și culturi. 2 s-au observat, de asemenea, modificări moleculare, cum ar fi creșterea producției de enzime catabolice (catepsină, lizozimă și mai multe metaloproteinaze matriciale) și citokine inflamatorii. 3 pacienții tineri cu hernie de disc lombar au prezentat o recuperare mai slabă după operație atunci când au prezentat concentrații serice crescute de proteină C reactivă de înaltă sensibilitate (hs-CRP) preoperator. Cu toate acestea, nu este clar dacă nivelurile ridicate de CRP și citokine inflamatorii indică o infecție locală sau un răspuns inflamator la hernia discului. 4

agenții patogeni precum virusul Parvo B19 sau virusul Epstein Barr (EBV) joacă un rol important în patogeneza diferitelor forme de artrită. 5,6 virusurile herpetice sunt o familie diversă de virusuri ADN mari, toate putând stabili infecții latente pe tot parcursul vieții. Infecția primară cu multe dintre aceste virusuri este frecventă în timpul copilăriei. 7,8

Acest studiu a urmărit investigarea rolului potențial al virusurilor herpetice, virusului Herpes Simplex tip 1(HSV-1), virusului Herpes Simplex tip 2 (HSV-2) și citomegalovirusului (CMV), în patogeneza degenerării discului intervertebral. O analiză moleculară a specimenelor de disc intervertebral obținute în timpul discectomiei a arătat o frecvență considerabilă a ADN-ului CMV și HSV-1 în discurile degenerate, sugerând că infecțiile virale ar putea fi un factor important în etiologia acestei boli.

pacienți și metode

au fost studiați un total de 16 pacienți consecutivi care au suferit discectomie în decurs de șase luni de la hernia discului lombar. Au fost opt bărbați și opt femei cu o vârstă medie de 40,38 ani (17-65). Studiul a avut aprobare etică. Diagnosticul herniei discului lombar a fost stabilit prin examen fizic și RMN. Pentru a furniza un grup de control, probele de discuri au fost obținute percutanat de la doi pacienți cu fracturi de spargere toracolumbară care au fost supuși operației. Acești pacienți au fost, de asemenea, supuși examinării RMN preoperatorii pentru a exclude degenerarea concomitentă. Natura probelor testate în acest studiu nu a permis includerea mai multor discuri intervertebrale de la indivizi sănătoși din motive etice, în timp ce alternativa specimenelor cadaverice ca controale, a fost abandonată, deoarece majoritatea populației adulte are antecedente de dureri de spate scăzute și degenerare a discului.

în plus față de materialul din hernia de disc obținut în timpul discectomiei a fost prelevată o probă de sânge periferic de la fiecare pacient. Probele de țesut au fost plasate în polipropilenă sterilizată 1.Tuburi de 5 ml și depozitate la -80 CTC, până la extracția ADN/ARN și reacția în lanț a polimerazei/ reacția cantitativă în lanț a polimerazei (PCR/qRT-PCR). Detectarea anticorpilor HSV-1 și CMV, IgM+ și IgG+ din plasmă a fost efectuată utilizând un test imunologic enzimatic standard.

extracția ADN / ARN.

ADN-ul Genomic și ARN-ul total au fost extrase din probele de țesut folosind kitul NucleoSpin Tissue XS și kitul NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel GmbH și Co., D utrogren, Germania), respectiv, conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul purificat a fost tratat în continuare cu DNaseI pentru a evita orice contaminare a ADN-ului. Concentrațiile probelor de ADN și ARN au fost determinate folosind un spectrofotometru (260 nm) înainte de amplificarea PCR sau qRT-PCR.

detectarea ADN-ului virusurilor herpetice.

am testat opt virusuri herpetice diferite (HSV-1 / -2, virusul varicelo-zosterian (VZV), EBV, CMV, virusurile herpetice umane 6, 7 și 8 (HHV6, HHV7 și HHV8)) folosind testul RhyMA-screeningul herpesului conform instrucțiunilor producătorului (Euroclone, Pavia, Italia). Testul RhyMA s-a bazat pe tehnologia de hibridizare inversă care implică amplificarea ADN multiplex prin PCR cu primeri biotinilați specifici, urmată de hibridizarea fragmentelor de ADN amplificat și biotinilat cu benzi pe sonde, specifice pentru fiecare dintre virusul herpes. Pentru evaluarea rezultatelor a fost necesară o reacție finală de dezvoltare utilizând un sistem biotină-streptavidină. Controalele pozitive și de amplificare au fost, de asemenea, incluse în fiecare bandă. Pentru interpretarea rezultatelor, banda dezvoltată a fiecărui eșantion a fost aliniată cu un tabel standard. Testul RhyMA – screeningul herpesului este autorizat pentru utilizarea diagnosticului in vitro, certificând specificitatea și sensibilitatea ridicată a testului. Pentru a verifica rezultatele obținute folosind testul RhyMA-testul de screening pentru Herpes, produsele PCR au fost, de asemenea, rulate într-un gel de agaroză cu topire scăzută de 3%, producând modelul electroforetic așteptat pentru fiecare virus. În cele din urmă, probele PCR-pozitive au fost supuse unei analize directe de secvențiere, confirmând rezultatele obținute utilizând testul RhyMA-testul de screening pentru Herpes.

HSV-1 și CMV qRT-PCR.

ARN-ul Total a fost transcris invers folosind kitul RETRO-script (Ambion Inc., Austin, Texas, SUA) cu grunduri hexamer aleatorii. ADNc-urile au fost testate pentru calitatea șablonului prin construirea curbelor standard folosind diluții seriale ale fiecărui ADNc ca șabloane în qRT-PCRs. Șabloanele ADNc au dat o eficiență a testului de 90% până la 105%, iar R2 al tuturor curbelor standard a fost > 0,98. În urma transcrierii inverse, ADNc au fost amplificate folosind primeri specifici ICP0 și IE1 pentru cuantificarea ARNm HSV-1 și respectiv HCMV, așa cum s-a descris anterior. 9,10

toate QRT-PCRs au fost efectuate în trei exemplare folosind Maxima SYBR Green qPCR master mix (Fermentas Inc., Glen Burnie, Maryland) într-un Detector de secvență ABI PRISM 7500 (pe Biosystems, Foster City, Canada), inclusiv probele de ARN extrase, precum și controalele pozitive și negative. Fluorescența verde SYBR a fost măsurată pe parcursul a 40 de cicluri de amplificare. Pentru fiecare șablon cuantificat, s-a calculat numărul mediu al ciclului la care acumularea produsului a intrat în intervalul liniar (CT). Valorile CT reproduse s-au situat între 0,4 cicluri una față de cealaltă. Valoarea CT 18SRRNA pentru un model dat a fost scăzută din CT obținută pentru fiecare ARNm de interes (ICP0 și IE1) din același model pentru a obține valoarea CT normalizată (CENTICCT) pentru fiecare model.

factorul de necroză tumorală-expresia genei interleukinei-6.

pentru cuantificarea ARNm-ului TNF-IL-6 sau IL-6, s-a utilizat 1 ilqtl de ADNc împreună cu primerii prezentați mai sus într-o reacție de 20 ilql, utilizând SYBR green ca marker pentru conținutul de ADN. Primerii utilizați au fost: beta actin: Forward: 5 ‘- TCAGAAGAACTC CTA TGT GG-3’, Reverse: 5 ‘- TCT CTT TGA TGT CAC GCA CG-3’; TNF-a Forward: 5 ‘- CAC GCT CTT CTG TCT act GAA CTT CG-3′, invers: 5′-GGC TGG GTA GAG AAT GGA TGA ACA CC-3′, 11 IL-6: înainte: 5′-ACA GCC ACT CAC CTC TTC AG -3′, invers: 5′-GTG CCT CTT TGC TGC TTT CAC -3’. 12 nu au fost prezenți subproduși în reacție, așa cum este indicat prin modelul de disociere furnizat la sfârșitul reacției și prin electroforeza în gel de agaroză (datele nu sunt prezentate). Eficiența de amplificare a produselor TNF-XV și IL-6 a fost aceeași cu cea a beta actinei, indicată de curbele standard de amplificare, permițându-ne să folosim formula: creștere de ori = 2–(A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A). Reacțiile au fost efectuate în trei exemplare pentru a permite evaluarea statistică.

rezultate

un test de hibridizare inversă PCR a fost utilizat pentru a examina ADN–ul a opt virusuri herpetice diferite în specimenele de disc intervertebral ale pacienților cu hernie de disc (Fig. 1). ADN-ul herpesvirusului a fost detectat la 13 din 16 exemplare (81,25%). HSV-1 a prezentat cea mai mare prevalență la nouă pacienți (56,25%), în timp ce CMV a fost detectat la șase pacienți (37,5%) (tabelul I). Doi pacienți au fost infectați concomitent atât cu HSV-1, cât și cu CMV. ADN-ul de la HSV-2, VZV, EBV, HHV6, HHV7 și HHV8 nu a fost detectat în probele de disc ale oricăruia dintre pacienți. Niciunul dintre pacienții de control (C1 și C2) nu a dat rezultate pozitive pentru prezența ADN-ului virusului herpes (Fig. 1).

statusul infecției cu HSV-1 și CMV, în probele de disc intervertebral a fost examinat prin investigarea expresiei potențiale a transcrierilor virale prin qRT-PCR în timp real. Expresia genei virusului Herpes nu a fost detectată în niciuna dintre probele testate, demonstrând absența unei infecții virale active, sugerând astfel stabilirea infecției latente cu herpesvirus la aceste specimene.

a fost examinată și seropozitivitatea pacienților. Toți pacienții cu HSV-1 sau CMV PCR-pozitivi au prezentat anticorpi IgG+ pentru același virus (tabelul I). În trei cazuri pentru HSV-1 și în șase cazuri pentru CMV, anticorpii IgG+ au fost detectați fără prevalență simultană a ADN-ului viral. Mai mult, anticorpii HSV-1 și CMV IgM+ din sângele periferic au fost negativi la toți pacienții, indicând faptul că niciunul dintre pacienți nu a prezentat o infecție acută cu virusul herpes în momentul exciziei chirurgicale.

în afară de indicația macroscopică a inflamației din jurul herniei de disc, am obținut și dovezi experimentale de inflamație la probele de disc intervertebral prin examinarea nivelurilor de ARNm ale TNF-XV și IL-6, în toate probele utilizând qRT-PCR. Analiza a arătat o creștere de aproximativ două până la trei ori a ambilor markeri inflamatori în probe comparativ cu martorii (Fig. 2). Interesant este că pacienții care au fost coinfectați atât cu HSV-1, cât și cu CMV au prezentat cele mai ridicate niveluri de TNF-XV și IL-6. În plus, doi din trei pacienți (pacienții 2 și 8) fără dovezi de infecție virală au prezentat niveluri mai scăzute de TNF-IX. Această corelație negativă nu a fost găsită pentru nivelurile de IL-6 la acești pacienți.

discuție

studiul de față sugerează conceptul că infecția cu virusul herpes ar putea promova degenerarea discului. Am putut detecta ADN-ul HSV – 1 și CMV într-un număr mare de probe de disc intervertebral uman recoltate în timpul discectomiei.

infecția anterioară de grad scăzut a fost sugerată ca o posibilă cauză a degenerării discului. 2,4 mai mulți autori au subliniat relația dintre semnalele modice de tip 1 (creșterea intensității semnalului măduvei în imaginile MR ponderate T2 și scăderea intensității semnalului în imaginile MR ponderate T1 și țesutul fibrovascular în plăcile finale) și infecție. 13,14 dacă pacienții nu prezintă dureri de spate severe, temperatură sau un profil sanguin anormal, este dificil să se facă distincția între modificările Modic 1 și infecția de grad scăzut. 13,14

relația dintre infecția virală și apoptoză a fost investigată pe larg, clarificând mecanismele inducerii apoptozei de către viruși. 15,16 acum se știe că parvovirusul B19 și în special proteina sa NS-1 are un efect citotoxic puternic asupra celulelor gazdă și provoacă apoptoză în celulele infectate. 17 viruși joacă un rol în patogeneza diferitelor forme de artrită. Stahl și colab. 5 au detectat ADN viral din mai multe virusuri în țesutul sinovial luat de la pacienții cu artrită precoce. Un studiu recent a sugerat că stadiile avansate ale osteoartritei pot fi legate de creșterea inflamației și deteriorarea cartilajului articular din cauza parvovirusului B19. 18 într-un alt studiu, sa propus că parvovirusul uman B19 este implicat în inițierea și perpetuarea sinovitei în artrita reumatoidă, ducând la leziuni articulare în cursul sintezei excesive a citokinelor inflamatorii și a enzimelor proteolitice. 19

infecțiile cu HSV-1 sunt endemice în întreaga lume. Peste 90% dintre adulți au anticorpi la HSV-1 până în deceniul al cincilea. Virusurile herpetice sunt agenți patogeni omniprezenți la copii, rămânând latenți după o infecție activă. 20,21 în faza inițială a infecției, replicarea virală are loc în ganglioni cu supraviețuirea unor celule care mențin genomul viral compatibil cu funcția celulară normală. Acest echilibru fin între celulele gazdă și virus poate fi perturbat de diverși stimuli, ducând la reactivare. 22

în studiul nostru, niciunul dintre pacienți nu a prezentat infecție acută cu herpes. Acest lucru a fost evident atât la nivel serologic, datorită absenței anticorpilor IgM+ din sângele periferic, cât și la nivel molecular datorită lipsei transcrierilor ARNm virale din probele de disc. Astfel, prevalența ridicată a infecției cu HSV-1 în copilărie, precum și reținerea acesteia în sistemul nervos, ar putea oferi o explicație satisfăcătoare a prezenței atât a HSV-1, cât și a CMV în discul intervertebral.

se pune întrebarea cum intră virușii în spațiul discului intervertebral. Este bine stabilit că canalele vasculare mari traversează plăcile finale în timpul vieții fetale timpurii, care ulterior scad odată cu nașterea și dispar în întregime până la vârsta de patru până la șase ani, făcând discul unul dintre cele mai mari tipuri de țesut avascular din organism. 23 s-ar putea specula că prezența ADN-ului viral în discul intervertebral este secundară migrării macrofagelor sau a altor celule care conțin ADN viral în disc în timpul copilăriei, în timp ce mediul discului este încă bogat în vase de sânge. Alte mecanisme ar putea juca, de asemenea, un rol, deoarece este bine cunoscut faptul că virusul herpes simplex poate fi activat în axonii neuronali prin citokine inflamatorii, cum ar fi IL-1 și TNF-24,25 și prin migrarea antidromală ar putea implica spațiul discului.astfel, discul inflamat sau rănit, care produce o varietate de citokine pro-inflamatorii, activează virusurile latente. Aceste mecanisme ar putea explica, de asemenea, prezența ADN-ului din două sau mai multe virusuri în probele de disc. Chiar dacă prezența virusurilor este un fenomen secundar, prezența lor poate contribui la patogeneza degenerării discului intervertebral, deoarece antigenele virale sporesc în continuare deteriorarea discului prin activarea mediului inflamator care facilitează macrofagele activate și alte celule să provoace leziuni tisulare.

în studiul nostru, evaluarea intraoperatorie a câmpului chirurgical a evidențiat dovezi macroscopice ale inflamației din jurul herniei de disc. Dovezile inflamației în specimenele de disc și contribuția infecției virale la intensificarea procesului inflamator au venit din analiza nivelurilor de ARNm ale genelor bine cunoscute, care sunt asociate cu inflamația, cum ar fi TNF-inktsikt și IL-6. Ambii markeri inflamatori au demonstrat niveluri de aproximativ două până la trei ori mai mari în probele pacienților comparativ cu grupurile de control. Interesant este că probele care au fost coinfectate atât de HSV-1, cât și de CMV au prezentat cele mai înalte niveluri de TNF-XV și IL-6, sugerând un efect sinergic al virusurilor. În plus, nivelurile de TNF-XV au fost la fel de scăzute ca și cazurile de control în rândul pacienților în care nu am putut detecta ADN viral.

un articol recent de revizuire afirmă că degenerarea discului nu este un diagnostic, ci o expresie a stării discului, care este rezultatul mai multor factori care acționează, individual sau colectiv. 1.în loc să fie rezultatul unui singur proces, degenerarea discului poate avea o serie de cauze posibile, inclusiv mecanice, îmbătrânire, genetice, sistemice, toxice și/sau infecții. Absența detectării virale la toți cei 16 pacienți este în concordanță cu cauzalitatea multifactorială a prolapsului discului. Se știe că factorii genetici produc componente anormale ale matricei 26-28 care compromit structura și funcția discului și cresc susceptibilitatea țesutului discului la stres mecanic. 29 studiile epidemiologice au arătat că factorii genetici cresc riscul de degenerare, 30-35 dar nu țin cont de toate cazurile, 28,36 cu variații între diferite populații etnice 37 astfel încât sunt necesare studii mari asupra populației multietnice. 38

prezența virusurilor în disc ar putea crea o setare în care discul este vulnerabil la deteriorarea prin stres mecanic și traume. Este probabil ca ADN-ul viral să fie prezent la nivelurile discurilor intervertebrale, dar tensiunile mecanice care sunt postulate pentru a contribui la degenerare au loc la nivelul lombosacral, unde problemele sunt mult mai frecvente. 1 infecția de grad scăzut, cu sau fără influență genetică, poate crește susceptibilitatea discului intervertebral la factorii de mediu, care determină secundar evenimentele biologice care duc la degenerarea discului. Posibil ADN herpes acționează ca un factor care modifică caracteristicile structurale ale matricei din disc prin modularea apoptozei și a răspunsului inflamator local, sugerând că infecția virală sau reactivarea este asociată cu boala.descoperirea de către Marshall și Warren 39 că infecția cu Helicobacter pylori a fost responsabilă pentru dezvoltarea ulcerelor gastrice a dus la o schimbare majoră în înțelegerea medicală. Posibilitatea ca un proces infecțios să contribuie la degenerarea discului trebuie luată în considerare în mod serios.

credem că acesta este primul studiu care documentează prezența virusurilor herpetice în discul intervertebral al pacienților cu hernie de disc. Sunt necesare studii suplimentare pentru a determina mecanismele care stau la baza și pentru a susține rolul potențial al virusurilor herpetice în patogeneza bolii degenerative de disc.

niciun beneficiu sub nicio formă nu a fost primit sau va fi primit de la o parte comercială legată direct sau indirect de subiectul acestui articol.