text

virușii experimentează medii destul de diferite, în funcție de faptul că se reproduc în interiorul unei celule gazdă sau în tranzit de la o gazdă la alta. Într-o celulă, virusul și componentele virusului sunt expuse unui mediu reducător, unde potențialul redox este determinat în principal de glutation (18). În schimb, în afara unei celule, virusul este expus oxigenului și produselor toxice derivate din oxigen, cum ar fi peroxidul de hidrogen, superoxidul și radicalul hidroxil, specii reactive care au potențialul de a inactiva virusul. Pentru a face față unor astfel de compuși foarte reactivi, plantele și animalele exprimă enzime capabile să le transforme în produse netoxice. Exemple de astfel de enzime sunt catalaza, peroxidazele și superoxid dismutaza (28). Aici, descriem rezultatele studiilor care demonstrează prezența catalazei în interiorul virionului herpes simplex purificat. Testele au fost apoi efectuate pentru a determina dacă catalaza internă ar putea proteja virusul de inactivarea prin H2O2.

studiile de catalază au fost efectuate cu virusul herpes simplex 1 (HSV-1) care a fost cultivat pe celule Vero în cultură și purificat prin centrifugare cu gradient de densitate de zaharoză. Când suspensiile de virus au fost ajustate la 1% H2O2, bulele de oxigen au început să se formeze prompt, indicând prezența catalazei (Fig. 1A, tubul stâng). Bulele au devenit vizibile vizual după câteva secunde de incubare la temperatura camerei și au continuat să se formeze și să se mărească timp de cel puțin 20 de minute. Cu toate acestea, nu s-au format bule dacă inhibitorul de catalază azida de sodiu a fost adăugată la suspensia de virus înainte de tratamentul cu H2O2 (Fig. 1a, dreapta). Testele au fost, de asemenea, negative atunci când (i) virusul a fost eliminat din soluție prin centrifugare înainte de adăugarea de H2O2 sau (ii) CAPSIDELE HSV-1 (B capsidele) au fost înlocuite cu virusul intact. În teste similare, bulele care indică prezența catalazei nu au fost observate la virusul stomatitei veziculoase purificate sau la adenovirusul uman 2 (Datele nu sunt prezentate). Analiza Western blot a confirmat prezența catalazei asociate cu virusul HSV-1, dar nu cu adenovirus, virusul stomatitei veziculoase (VSV) sau CAPSIDELE HSV-1 A (Fig. 1b).

identificarea catalazei asociate HSV-1 prin analiza enzimatică (a), analiza Western blot (b) și centrifugarea gradientului de densitate a zaharozei (c). Panoul a prezintă un tub care conține HSV-1 purificat la 20 de minute după ce soluția a fost ajustată la 1% H2O2 (tubul stâng) și o incubare similară la care a fost adăugat un inhibitor de catalază (azidă de sodiu de 2 mM) înainte de H2O2 (dreapta). Observați formarea bulelor în tubul stâng, indicând prezența catalazei în virus. Concentrația virusului a fost de 0,25 mg / ml în TNE (0,01 M Tris-HCl, 0,5 M Naci, 1 mm EDTA, pH 7,5), iar incubarea a fost la temperatura camerei. Virusul a fost tulpina Kos a HSV-1, care a fost cultivată pe culturi monostrat de celule Vero și purificată prin centrifugare cu gradient de densitate de zaharoză, iar titrul a fost determinat prin diluarea punctului final așa cum s-a descris anterior (14). Panoul b prezintă rezultatele unui test Western blot pentru prezența catalazei în HSV-1, adenovirusul uman 2 (HAd2), virusul stomatitei veziculoase (VSV) și CAPSIDELE HSV-1 A. Adenovirusul uman 2 și virusul stomatitei veziculoase (Indiana; Tulpina San Juan) au fost cultivate pe culturi monostrat de celule hela și, respectiv, Vero și purificate prin proceduri descrise anterior (12, 17). Metodele publicate au fost, de asemenea, utilizate pentru purificarea CAPSIDELOR HSV-1 A și B (23). Proteinele majore de capsidă au fost detectate prin colorarea blotului cu 1% Ponceau S (rândul superior), în timp ce catalaza a fost detectată prin imunosupresie cu anticorp specific pentru catalază (Calbiochem; policlonal de iepure 219010; diluție 1:5.000) (15). Rețineți că catalaza a fost detectată în virusul HSV-1, dar nu în Capsidele HAd2, VSV sau HSV-1 A. Panoul c prezintă rezultatele analizei gradientului densității zaharozei. Un total de 50 de hectolitri de HSV-1 purificat în 50 de CENTICLI a fost centrifugat pe un gradient de 600 de centicli de 20% până la 50% zaharoză în TSN. Centrifugarea a fost timp de 45 min la 22.000 rpm într-un rotor Beckman SW55 la 4 centi C. gradientul a fost fracționat, iar fracțiile individuale au fost analizate prin SDS-PAGE urmată de blotting pe difluorură de poliviniliden (PVDF) și colorare cu 1% Ponceau S. blotul a fost apoi destained și colorat cu anticorp specific pentru catalază (care a migrat coincident cu catalaza standard; Worthington LS001872). Rețineți că poziția virusului în gradient (rândul de sus) coincide cu cea a catalazei (rândul de jos), sugerând că cele două sunt asociate.

au fost efectuate experimente de Control pentru a confirma că catalaza a fost asociată cu HSV-1 și nu cu impuritățile prezente în preparatul de virus. HSV-1 purificat a fost centrifugat într-o bandă pe un gradient de densitate de zaharoză, gradientul a fost fracționat și analiza Western blot a fost utilizată pentru a testa fracțiile individuale de gradient pentru prezența catalazei. Rezultatele au arătat că catalaza a fost prezentă în fracțiile care conțin virus, dar nu și în cele flancante (Fig. 1c). Rezultatele sunt interpretate pentru a indica faptul că catalaza este asociată cu HSV-1 și nu cu contaminanți, cum ar fi bacteriile care conțin catalază sau materialele celulare gazdă din preparatul virusului. Deoarece genomul HSV-1 nu codifică catalaza (22), enzima asociată virusului trebuie derivată din celula gazdă. Studiile timpurii ale virusului vaccinia au demonstrat prezența catalazei în interiorul virionului Matur (8). În afară de această observație, nu cunoaștem niciun alt raport al catalazei ca componentă a structurii virusului.

analiza ulterioară a catalazei asociate HSV-1 a avut ca scop determinarea localizării enzimei în virion. Au fost făcute două tipuri de experimente. În primul rând, virusul purificat a fost tratat cu enzima proteolitică pronază pentru a degrada glicoproteinele virusului și orice proteine care nu sunt conținute în membrana virionului. S-a așteptat ca proteinele virale interne să nu fie afectate, deoarece pronaza nu traversează bistratul lipidic al virusului (16). După tratamentul cu pronază, virusul a fost recoltat prin centrifugare, iar gradul de pierdere a catalazei a fost determinat prin analiza Western blot. Rezultatele nu au arătat nicio dovadă a pierderii catalazei în două concentrații de virus testate (vezi banda catalazei din Fig. 2A, benzile 1 și 2). Controalele interne au demonstrat că glicoproteinele de suprafață ale virusului gB și gH au fost scindate conform așteptărilor (Fig. 2A; comparați benzile 2 și 3). În mod similar, analiza Western blot a demonstrat că glicoproteina D HSV-1 a fost digerată de pronază sau tripsină în condiții în care catalaza nu a fost afectată (Fig. 2b). Catalaza purificată în soluție a fost, de asemenea, digerată în aceleași condiții. În schimb, nici o degradare a tegumentului intern (UL47, UL48 și UL49) sau a proteinelor capsidice (UL19, UL38, UL18; Fig. 2A, benzile 1 și 2) a fost observată. Rezultatele sunt interpretate pentru a indica faptul că catalaza este localizată în interiorul învelișului HSV-1.

localizarea catalazei în HSV-1 prin tratarea virionilor purificați cu pronază (benzile 1 până la 3) și Triton X-100 (a, benzile 4 și 5) și prin tratamentul pronazei și tripsinei (B, benzile 1 până la 3). Panoul a prezintă analiza SDS-PAGE și Western blot a proteinelor prezente în HSV-1 intact (benzile 3 și 4) și în virioni după tratamentul cu pronază (benzile 1 și 2) și Triton X-100 (banda 5). Rețineți că s-a constatat că catalaza este prezentă în virionii intacti (benzile 3 și 4) și în virionii tratați cu pronază (benzile 1 și 2), dar nu și în virioni după tratamentul cu 1% Triton X-100 (banda 5). Tratamentul cu pronază s-a efectuat prin digerarea HSV-1 purificat (0,25 mg/ml) cu pronază de 1 mg/ml (Streptomyces griseus; Calbiochem 537088) timp de 4 ore la 37 C. După tratamentul cu pronază, virusul a fost reisolat prin centrifugarea gradientului de densitate a zaharozei înainte de analiza SDS-PAGE și Western blot. Tratamentul cu Triton X-100 a fost efectuat prin ajustarea virusului purificat la 1% Triton X-100 în tampon TNE conținând ditiotreitol de 10 mM (DTT) și incubarea timp de 15 minute pe gheață (4 c). Capsidele rezultate au fost apoi purificate prin centrifugare cu gradient de zaharoză înainte de analiza SDS-PAGE și Western blot. (b) analiza Western blot a HSV-1 purificat după tratamentul in vitro cu pronază sau tripsină. Un total de 100 unqql de HSV-1 purificat (1 mg/ml) a fost ajustat la 2 mg/ml pronază sau 2 mg/ml tripsină. O incubare de control nu a avut nici o enzimă. Amestecurile au fost incubate timp de 2 ore la 37 C, iar virionii au fost purificați departe de enzime prin centrifugare pe un gradient de zaharoză de 20% până la 50%, așa cum este descris în legenda din Fig. 1. Probele de Virus au fost granulate prin centrifugare și examinate prin analiza SDS-PAGE și Western blot. Bloturile au fost colorate pentru catalază (policlonală de iepure; vezi mai sus) și glicoproteina D (anticorp monoclonal de șoarece DL11; un cadou de la Gary Cohen și Roselyn Eisenberg; 1:5.000). Rețineți că tratamentul cu protează a provocat digestia glicoproteinei D, dar nu catalază, indicând faptul că catalaza este localizată în interiorul membranei HSV-1.

o definiție mai precisă pentru localizarea catalazei a fost obținută prin tratarea virusului purificat cu detergentul neionic Triton X-100 (TX-100). Când se efectuează cu virus proaspăt, acest tratament determină pierderea membranei virusului, a glicoproteinelor membranei și a aproape tuturor celor 20 sau mai multe proteine tegument (toate, cu excepția UL36, UL37 și US3) (13, 21, 27). Capsida își păstrează totuși integritatea și niciuna dintre proteinele majore ale capsidei nu se pierde. ADN-ul virusului este reținut în interiorul capsidei. Experimentele au implicat tratarea HSV-1 cu 1% TX-100 și izolarea capsidelor rezultate prin centrifugarea gradientului de densitate de zaharoză. Analiza Western blot a fost apoi utilizată pentru a testa capsidele pentru prezența catalazei. Rezultatele au demonstrat că glicoproteinele virale și proteinele tegumente au fost îndepărtate conform așteptărilor și că și catalaza a fost îndepărtată (vezi Fig. 2A, benzile 4 și 5). Acest experiment este interpretat pentru a indica faptul că catalaza este prezentă în tegumentul HSV-1.

informații precum cele prezentate în Fig. 2 poate fi utilizat pentru a determina numărul de molecule de catalază per virion HSV-1 (15). Această măsurare a fost efectuată începând cu două alicote identice de virus purificat. Cele două au fost utilizate pentru determinarea (i) numărului de molecule majore de proteine capsidice (UL19) dintr-un gel colorat cu albastru Coomassie și (ii) numărului de molecule de catalază 60-kDa dintr-un Western Blot calibrat. Într-o determinare reprezentativă, această analiză a dat o valoare de 1:207,5 pentru raportul molar al catalazei la UL19. Deoarece există 955 de molecule UL19 pe capsidă HSV-1, Numărul de molecule de catalază pe capsidă a fost determinat a fi 955/207, 5 sau 4.6. O a doua determinare similară a dat o valoare de 7,1 molecule de catalază. Deoarece există patru subunități de 60-kDa într-o moleculă activă de catalază (11, 20), rezultatele indică prezența a 1 până la 2 tetrameri de catalază pe virion.

prezența catalazei în VIRIONUL HSV-1 sugerează posibilitatea ca aceasta să fie implicată în protecția virusului împotriva daunelor oxidative cauzate de H2O2. Alternativ, catalaza poate fi încorporată pasiv în HSV-1, deoarece tegumentul este adăugat în citoplasma celulei gazdă și nu are nicio funcție protectoare. Pentru a distinge între cele două posibilități, am examinat sensibilitatea HSV-1 purificat la inactivarea prin h2o2in vitro. HSV-1 a fost tratat cu H2O2 în prezența sau absența inhibitorului de catalază azidă de sodiu (NaN3), iar titrul de virus a fost determinat ulterior (în absența inhibitorului de catalază). Rezultatele au arătat că, în timp ce 50 mM H2O2 a produs o scădere modestă a titrului (de 3 până la 4 ori), un efect letal de 106 ori sau mai mare a fost observat dacă NaN3 a fost prezent (tabelul 1). Experimentele de Control au arătat puține ucideri ale HSV-1 numai de NaN3 (Tabelul 1). Rezultatele sunt interpretate pentru a indica faptul că catalaza oferă un nivel semnificativ de protecție împotriva inactivării HSV-1 de către H2O2.