4.7 Protein Folding și bolile asociate

proteinele sunt sintetizate pe ribozomi ca polipeptide născute în lumenul reticulului endoplasmatic (ER). Secvența de aminoacizi a proteinelor care determină structurile secundare și terțiare este dictată de secvența nucleotidică a ARNm. La rândul lor, secvențele ARNm sunt determinate de secvențe ADN (capitolele 23-25232425). Așa cum am discutat mai devreme, experimentele clasice ale lui Pauling și Anfinsen au condus la conceptele că anumiți aminoacizi cheie în pozițiile adecvate sunt esențiali pentru plierea proteinelor într-o conformație tridimensională, funcțională, unică. Este uimitor faptul că, din sute de milioane de posibilități conformaționale, doar o singură formă conformațională este asociată cu o proteină funcțională. Procesul de direcționare și direcționare a plierii polipeptidelor intermediare către structurile complet pliate este ajutat, în unele cazuri, de proteine cunoscute sub numele de chaperone moleculare (numite și chaperonine) (figura 4-13).

figura 4-13. Calea de pliere a proteinelor. Plierea normală are loc cu ajutorul chaperonelor și a altor factori. Plierea greșită a polipeptidelor poate duce la direcționarea către locații celulare inadecvate sau la degradare ca parte a procesului de control al calității sau la agregare. Produsul agregat este adesea rezistent la proteoliză și formează agregate, cum ar fi plăcile amiloide.

Chaperonele se leagă reversibil de segmentele polipeptidice desfăcute și împiedică plierea lor greșită și agregarea prematură. Acest proces implică cheltuieli de energie furnizate de hidroliza ATP. O clasă majoră de chaper-ones sunt proteinele de șoc termic (hsp), care sunt sintetizate atât în celulele procariote, cât și în celulele eucariote ca răspuns la șocul termic sau la alte solicitări (de exemplu, expunerea la radicalii liberi). Există multe clase de chaperone cu șoc termic (HSP-60, HSP-70 și HSP-90) care sunt prezente în diferite organite ale celulei. Chaperonele HSP – 70 conțin două domenii: un domeniu ATPază și un domeniu de legare a peptidelor. Ele stabilizează polipeptidele născute și, de asemenea, sunt capabile să reconformeze forme denaturate de polipeptide. Familia de chaperone HSP – 70 prezintă un grad ridicat de omologie a secvenței între diferite specii (de exemplu, E. coli și proteinele umane HSP-70 prezintă 50% omologie a secvenței).

un alt însoțitor, calnexin, este o proteină de legare a Ca2+de 90 kDa și este o fosfoproteină cu membrană integrală a ER. Calnexin monitorizează exportul de glicoproteine nou sintetizate prin complexare cu glicoproteine pliate greșit care au suferit glicozilare (Capitolul 16). Dacă o proteină nu poate fi pliată în conformația sa adecvată, însoțitorii ajută la distrugere. Procesul de pliere este facilitat și de mediul ionic, cofactori și enzime. De exemplu, plierea este afectată de izomeraza disulfură de proteine, care catalizează formarea legăturilor disulfidice corecte și de izomerazele peptidil prolil, care catalizează izomerizarea cis-trans a legăturilor peptidice specifice aminoacidului-prolină.

un sindrom de demență caracterizat printr-un declin progresiv insidios al memoriei, cogniției, stabilității comportamentale și funcției independente a fost descris de Alois Alzheimer și este cunoscut sub numele de boala Alzheimer (AD). Vârsta este un factor de risc important pentru AD; afectează 10% dintre persoanele cu vârsta peste 65 de ani și aproximativ 40% dintre cei cu vârsta peste 85 de ani. Modificările neuropatologice caracteristice includ formarea plăcilor neuritice extracelulare și a încurcăturilor intraneuronale cu pierderea neuronală asociată în hipocamp și neocortex (figura 4-14).

figura 4-14. Secțiune a cortexului cerebral de la un pacient cu boala Alzheimer care conține încurcătură neurofibrilară (a) și placă neuritică (b). Secțiunea a fost procesată cu pata lui Bielsehowsky. (Prin amabilitatea lui John M. Hardman.)

constituentul major al plăcilor extracelulare este amiloidul protein-amiloid (A), care se agregă în filamente de 8 nm. Un XV este o peptidă de 40 sau 42 de reziduuri de aminoacizi și este derivată proteolitic dintr-o glicoproteină transmembranară cunoscută sub numele de proteină precursoare de amiloid-amiloid (app). Enzimele care scindează de la un Xixt sunt cunoscute sub numele de secretaze. în special în creier, iar gena sa a fost localizată la cromozomul 21Q. două observații majore au ajutat la înțelegerea rolului unei peptide de la suta în patologia bolii Alzheimer. Primul este că pacienții cu sindrom Down au trisomia 21 (adică., trei cromozomi 21 în loc de doi), prezintă depozite de un sfert de milion și dezvoltă trăsături clasice ale bolii Alzheimer la vârsta de 40 de ani sau mai devreme. În al doilea rând, au fost identificate mai multe mutații missense în cazul bolii Alzheimer autosomale dominante. Aceste mutatii dominante in cazul in care actiunea secretazelor este afectata in mod negativ, fie prin cresterea ratei absolute de excretie in cazul in care se produce o excretie in cazul in care se produc mutatii n-terminale, fie prin cresterea raportului in cazul in care se produce o excretie in cazul in care se produc mutatii n-terminale, fie prin cresterea raportului in cazul in care se produce o excretie in cazul in care se produc mutatii n-terminale.

tulburările moștenite ale bolii Alzheimer reprezintă mai puțin de 1% din toate cazurile. Peptidele a-Xixt se agregă pentru a forma structuri-xixt care conduc la fibrile. Peptidele a Inq42 sunt mai neurotoxice și produc efecte toxice prin multe mecanisme interdependente. Acestea pot implica leziuni oxidative, modificări ale homeostaziei intracelulare Ca2+, reorganizare citoscheletală și acțiuni ale citokinelor.

încurcăturile intraneuronale sunt mănunchiuri de filamente elicoidale lungi pereche care constau din proteina tau asociată microtubulilor. Funcția normală a proteinei tau este de a stabiliza microtubulii din neuroni prin îmbunătățirea polimerizării tubulinei. În mod normal, proteina tau este solubilă; cu toate acestea, atunci când este excesiv fosforilat, se transformă într-un polimer filamentos insolubil. Dereglarea evenimentelor de fosforilare / defosforilare a fost atribuită unei activități sporite a anumitor kinaze și unei activități diminuate a anumitor fosfataze. În timp ce plăcile sunt patognomonice pentru AD, încurcăturile se găsesc în boli neurologice etiologic diferite. Tulburările de hiperfosforilare anormală și agregarea aberantă a proteinei tau în polimeri fibrilari sunt cunoscute sub numele de taupatii. Exemple de taupatii în plus față de AD sunt paralizia supranucleară progresivă, boala Pick, degenerarea corticobazală și demențele frontotemporale.

alte două gene, în plus față de centicapp, au fost implicate în debutul precoce al formelor dominante autozomale ale bolii Alzheimer. Celelalte două gene cauzale sunt localizate pe cromozomii 14 și 1 și codifică proteinele transmembranarepresenilina 1 (constând din 467 reziduuri de aminoacizi) și presenilina 2 (constând din 448 reziduuri de aminoacizi). Aceste proteine sunt sintetizate în neuroni, dar funcțiile lor nu sunt cunoscute. Cu toate acestea, mutațiile în genele presenilinei duc la producerea excesivă a unei peptide de tip Xq42.

formele sporadice ale bolii Alzheimer, responsabile pentru 90% din toate cazurile, sunt boli complexe și pot reprezenta acțiunea combinată atât a factorilor de mediu, cât și a trăsăturilor genetice care se manifestă pe perioade lungi de timp. Diferite forme ale unei gene polimorfe pentru apolipoproteina E (apo E) care se află pe cromozomul 19 s-au dovedit a apărea în frecvență mai mare la persoanele cu boala Alzheimer. Există trei alele ale genei apo e cu șase combinații: ε2/ε2, ε3/ε3, ε4/ε4, ε2/ε3, ε2/ε4, și ε3/ε4. Apo E este o proteină purtătoare de lipide care este sintetizată în principal în ficat; cu toate acestea, este sintetizată și în astrocite și neuroni. Funcția proteinelor apo e în metabolismul lipoproteinelor și relația lor cu ateroscleroza prematură sunt discutate în capitolul 20.

dintre mai multe genotipuri pentru apo E, achiziționarea a două alele apo e XV4 poate crește riscul de boală Alzheimer de până la opt ori. Fiecare copie a genei apo e crește riscul și mută debutul la vârste mai mici. Nu este clar mecanismul biochimic prin care proteina apo e XV4 participă la formarea de încurcături și plăci. Au fost sugerate mai multe mecanisme, și anume, interacțiunea cu proteina tau și generarea și clearance-ul unei peptide cu un număr de opt.

terapia farmacologică pentru boala Alzheimer constă în corectarea deficitului colinergic prin administrarea inhibitorilor de acetilcolinesterază (de exemplu, tacrină, donepezil). Terapia cu Estrogen la femeile cu boala Alzheimer a fost asociată cu performanțe cognitive îmbunătățite. Efectul benefic al estrogenului se poate datora acțiunilor colinergice și neurotrofice. Alte strategii terapeutice sunt îndreptate spre inhibarea sau scăderea formării peptidelor neurotoxice. În plus, medicamentele care digeră selectiv peptidele agregate se pot dovedi utile. Un vaccin experimental care conține peptidă AP administrată șoarecilor producători de plăci duce la formarea mai mică a plăcii la șoarecii mai tineri și la dispariția plăcilor la șoarecii mai în vârstă. Modificările în formarea plăcii la șoareci au fost asociate cu conservarea memoriei și a capacității de învățare. Vaccinarea nu a declanșat un răspuns autoimun sau o reacție toxică la animalele experimentale. Astfel, aceste studii au oferit un impuls pentru dezvoltarea unui vaccin uman.

în evaluarea unui pacient pentru boala Alzheimer, este esențial ca alte cauze tratabile ale demenței să fie excluse prin determinarea parametrilor biochimici și clinici critici. Unele dintre anomaliile tratabile, relativ frecvente, care produc demență includ abuzul de droguri, dezechilibrul electrolitic, anomaliile tiroidiene și deficitul de vitamina B12; anomaliile mai puțin frecvente sunt tumora, accidentul vascular cerebral și encefalopatia Wernicke.

amiloidoza transtiretină (numită și polineuropatie amiloidă familială) este un sindrom autozomal dominant caracterizat prin neuropatie periferică. Această boală rezultă dintr-una din cele cinci mutații identificate până acum în gena pentru transtiretină. Transtiretina se mai numește prealbumină (deși nu are nicio relație structurală cu albumina), deoarece migrează înaintea albuminei în electroforeza standard la pH 8,6. Transtiretina este sintetizată în ficat și este o proteină plasmatică normală cu o concentrație de 20-40 mg/dl. Transportă proteina care leagă tiroxina și retinolul (Capitolul 38). Concentrația de transtiretină este semnificativ scăzută în malnutriție, iar nivelurile plasmatice sunt diagnostice ale tulburărilor de malnutriție (Capitolul 17).

gena pentru transtiretină se află pe cromozomul 18 și este exprimată într-o manieră constitutivă. Structura primară a transtiretinei este formată din 127 de reziduuri de aminoacizi și opt structuri de foi de un sfert dispuse într-o conformație antiparalelă pe planuri paralele (figura 4-15).

figura 4-15. Structura transtiretinei. Molecula conține opt catene antiparalelice (A-H) dispuse în două planuri paralele. Forma circulantă a transtiretinei este un tetramer. Unele mutații ale genei transtiretinei sunt asociate cu amiloidoza și sunt indicate opt dintre modificările aminoacizilor care cauzează această boală. În plasmă, transtiretina este un tetramer compus din monomeri identici. Se pare că mutațiile determină intermediarul monomer desfășurat al transtiretinei să se agregeze într-o formare insolubilă de fibril amiloid-amiloid.

Est pot prezenta moștenite, infecțioase și prezentări sporadice. În plus, boala moștenită poate fi, de asemenea, infecțioasă. CJD apare atât ca o tulburare dominantă autosomală moștenită, cât și într-o formă transmisibilă. În ipoteza „numai proteine”, Proteina prionică anormală, fie introdusă din surse externe, fie produsă de gena proteinei prionice mutante, afectează plierea normală a proteinelor și deplasează plierea proteinei prionice spre formarea proteinei prionice anormale. Conversia proteinei prionice normale, a cărei funcție este necunoscută, într-o formă aberantă implică mai degrabă o schimbare conformațională decât o modificare covalentă. Proteina prionică anormală funcționează ca o sămânță care induce proteina prionică celulară normală spre proteinele anormale bogate în amiloidogenice, cu structură de la sută, care pot fi propagate și transmise altor celule. Forma agregată a proteinei prionice care formează amiloid este rezistentă la proteoliză.

conversia proteinei prionice sensibile la protează în mod natural într-o formă rezistentă la protează are loc in vitro prin amestecarea celor două proteine. Cu toate acestea, aceste proteine prionice rezistente la protează nu sunt infecțioase. Astfel, în ipoteza” numai proteine ” a infecției cu prioni, dobândirea unei conformații abherante nu este suficientă pentru propagarea infecțiozității. Cu toate acestea, în sistemul de drojdie (Saccharomyces cerevisiae), forma prionică anormală a proteinei de drojdie, introdusă prin fuziunea lipozomilor, este capabilă să însămânțeze o schimbare conformațională auto-propagatoare a proteinelor normale, care se acumulează ca agregate. Agregatele sunt transmisibile la celulele de drojdie fiică împreună cu propagarea fenotipului anormal.

recent, a apărut o problemă gravă de sănătate publică, arătând că o boală prionică la bovine poate traversa barierele speciilor și poate infecta oamenii. Acest lucru a avut loc atunci când bovinele au fost hrănite cu făină obținută din oi infectate cu scrapie. Bovinele au dezvoltat ESB (denumită în mod obișnuit „boala vacii nebune”). Ulterior, când oamenii au consumat carne de vită contaminată cu prioni, un număr mic, în principal în Marea Britanie, a dezvoltat o variantă de CJD (vCJD) aproximativ cinci ani după aceea. Forma variantă a CJD este o formă unică de boală prionică care apare la o populație mult mai tânără decât s-ar aștepta de la CJD moștenit sau sporadic. Atât ESB, cât și vCJD împărtășesc multe caracteristici patologice similare, sugerând o legătură etiologică între vCJD umană și ESB bovine.

proteina supresoare tumorală p53 oferă încă un exemplu de pliere greșită a proteinelor care poate duce la efecte patologice, în acest caz cancere (p este pentru proteine și 53 este pentru greutatea sa moleculară aproximativă de 53.000). Gena pentru p53 este localizată pe brațul scurt al cromozomului 17 (17 p) și codifică o fosfoproteină 393-amino-acidă. În multe tipuri de cancer, gena p53 este mutantă, iar lipsa proteinei normale p53 a fost legată de dezvoltarea a până la 40% din cancerele umane.

p53 normal funcționează ca un supresor tumoral și este un factor de transcripție care participă în mod normal la reglarea mai multor gene necesare pentru a controla creșterea celulară, repararea ADN-ului șiapoptoza (moartea celulară programată). Normal p53 este un tetramer și se leagă de ADN într-o manieră specifică secvenței. Una dintre genele reglementate de p53 produce o proteină cunoscută sub numele de p21, care interferează cu ciclul celular prin legarea la ciclin kinaze. Alte gene reglementate de p53 sunt MDM2 și BAX. Fosta gena codifică o proteină care inhibă acțiunea p53 funcționând ca parte a unui mecanism de feedback de reglementare. Se crede că proteina produsă de gena BAX joacă un rol în apoptoza indusă de p53.

majoritatea mutațiilor genelor p53 sunt mutații somatice missense care implică substituții de aminoacizi în domeniul legării ADN-ului. Formele mutante ale p53 sunt proteine pliate greșit cu conformații anormale și incapacitatea de a se lega de ADN sau sunt mai puțin stabile. Persoanele cu tulburare rară sindromul Li-Fraumeni, (o trăsătură dominantă autosomală) au o genă p53 mutantă și o genă p53 normală. Acești indivizi au crescut susceptibilitatea la multe tipuri de cancer, cum ar fi leucemia, carcinoamele mamare, sarcoamele țesuturilor moi, tumorile cerebrale și osteosarcoamele.

studiile clinice sunt în curs de desfășurare pentru a investiga dacă introducerea genei normale p53 în celulele tumorale prin intermediul terapiei genice (Capitolul 23) are efecte benefice în tratamentul cancerului. Rezultatele timpurii cu terapia genică p53 indică faptul că poate micsora tumora prin declanșarea apoptozei.