Taq polymeras är ett av de mest allestädes närvarande enzymerna inom molekylärbiologi. Sedan upptäckten 19651 har Taq blivit ryggraden i PCR och alla nedströms applikationer som tekniken möjliggör. Detta kraftfulla polymeras är standardvalet för de flesta amplifierings-och kloningsprocedurer, såväl som diagnostiska tester, markörgen-DNA-sekvensering och mycket mer.

vad gör Taq polymeras så speciellt? I dagens artikel tar vi en titt på fördelarna och nackdelarna med Taq, vad du behöver för att få de bästa PCR-resultaten från Taq-polymeras och några Taq-derivat som kan hjälpa dig att uppnå bättre resultat för specialiserade applikationer.

varför används Taq så mycket för PCR?

taqs Popularitet drar nytta av det faktum att det var det första högtemperaturpolymeras som upptäcktes av molekylärbiologer. Men det är långt ifrån den enda anledningen till att den fortfarande är i så hög efterfrågan idag.

Taq-polymeras har den viktiga egenskapen att vara stabil vid temperaturer upp till 95 kg C2. Det är kritiskt eftersom det här är temperaturen vid vilken DNA denaturerar – ett nödvändigt steg i början av PCR-reaktionen. Medan alla polymeras med måttlig temperatur också skulle denaturera vid den temperaturen, vilket gör det värdelöst, är Taq helt redo att börja polymerisera ditt mål-DNA-prov.

dessutom har Taq fördelen att vara mest aktiv i temperaturintervallet 70-80 CC2. Det är tillräckligt varmt att DNA inte kommer att reanneal, men primers som har glödgat vid lägre temperaturer kommer inte heller att avskalas. Så, Taq-polymeras fungerar extremt bra vid de temperaturer som de flesta vanliga PCR-reaktioner kräver.

slutligen passar Taq grundläggande molekylärbiologiska behov extremt bra. Polymeraset lämnar a-tailed produkter, som enkelt kan klonas till en vektor med hjälp av ett standard ta-kloningsats. Taq är också relativt motståndskraftig mot DNA-sekvenser med ett brett spektrum av GC-innehåll och är inte så kräsen om mål-DNA eller dNTP-koncentrationer.

Vad behöver Taq för att polymerisera effektivt?

Om du helt enkelt lagt till Taq-polymeras på egen hand till ett DNA-prov, skulle inte mycket hända. Det beror på att Taq, som de flesta enzymer, behöver en specialiserad blandning av reagenser för att fungera korrekt.

den grundläggande Taq-bufferten innehåller kaliumklorid, Tris-hydroklorid och Triton X-100. Dessa kemikalier är mindre relevanta för att optimera dina PCR-reaktioner än att hålla Taq säker under lagring i frysen – vilket i sig är viktigt för att få ut det mesta av dina PCRs. Medan du kan göra din egen buffert för att rehydrera och lagra lyofiliserat Taq-enzym, säljs den stora majoriteten av polymeras som en masterblandning med Taq som redan är upphängd i den erforderliga buffertlösningen.

mer avgörande för dina PCR-reaktioner är magnesiumklorid. Magnesium är en väsentlig kofaktor för Taq-polymeras3. Utan det kommer Taq inte att kunna katalysera tillsatsen av nukleotider till primern eller växande DNA-strängen. Koncentrationen av magnesium spelar också roll. När mer magnesium tillsätts till en PCR-reaktion blir Taq mer aktiv, men också mindre specifik för att polymerisera endast din mål-DNA-sträng.

på grund av magnesiumens koncentrationsberoende roll kan du hitta Taq master-blandningar med magnesium som redan ingår samt blandningar som lämnar ut det. I det senare fallet måste du lägga till magnesiumklorid separat (vilket kräver ett extra pipetteringssteg när du förbereder dina PCRs). Fördelen är att du kan kontrollera den exakta koncentrationen av magnesium, så att du kan experimentera för att hitta den mest optimala blandningen av Taq-produktivitet och specificitet.

vilka är problemen med Taq-polymeras?

Taq används ofta för rutin PCR, men tyvärr är det inte perfekt för alla applikationer. Den mest anmärkningsvärda nackdelen med Taq är att det inte är det mest exakta polymeraset där ute. Taq har en felfrekvens på cirka ett fel per 100 000 baspar4. Som jämförelse är PFU-korrekturläsningspolymeras cirka 10 gånger mer exakt. Om du använder PCR uppströms kloning eller DNA-sekvensering kan den skillnaden i felfrekvens vara mycket signifikant.

Standard Taq-polymeras kan också ha problem med att förstärka mål-DNA-sekvenser längre än cirka 1 kB. I förhållande till andra typer av polymeraser har Taq låg processivitet, vilket innebär att dess effektivitet minskar avsevärt med längden på din amplicon. Denna låga processivitet kan förvärras av närvaron av PCR-hämmare, som är vanliga om du arbetar med DNA extraherat från vävnader, växter eller jord.

slutligen, medan Taq-polymeras är mest effektivt vid temperaturer över 70 kg C, fortsätter enzymet att arbeta vid temperaturer mindre än 50 kg C. Det är problematiskt eftersom Taq oavsiktligt kan polymerisera primers eller icke-mål-DNA-sekvenser när temperaturen i din PCR-reaktion faller för att tillåta primers att glödga till din målsekvens. Som ett resultat är Taq känt för att producera primerdimerer och andra oönskade produkter som kan komma i vägen för nedströms applikationer som kloning.

specialiserade Taq-polymeraser för avancerade applikationer

Tack och lov finns det specialiserade former av Taq-polymeras som löser några av dessa problem. HighQu ALLin Taq polymeras är till exempel en syntetisk version av Taq som har mer processivitet än standard Taq. Som ett resultat kan du lättare uppnå ampliconutbyten från hög-GC-mallar, mallar längre än 1 kB i längd och prover med måttliga koncentrationer av hämmare.

en annan vanlig form av Taq, som ALLin Hot Start Taq, är konstruerad med en molekylär hämmare för att göra den inaktiv vid lägre temperaturer. Hot start Taq fungerar endast efter uppvärmning till 95 C. Det minskar dramatiskt bildningen av primerdimerer och icke-specifika amplikoner som ett resultat av polymerisation före starten av dina PCR-reaktioner. Som ett resultat kan du få högre avkastning när du arbetar med längre målsekvenser och skära ner på bakgrundsamplikoner som normalt kräver sanering.

slutsats

Taq-polymeras har länge varit det enzym som valts för både rutinmässiga och komplexa PCR-applikationer. Det passar perfekt kraven i PCR-reaktionen, samtidigt som det gör nedströms applikationer som kloning och sekvensering enkla. Även om standard Taq har vissa nackdelar löses dessa till stor del genom att använda ett konstruerat eller hett start Taq-polymeras. För de allra flesta applikationer förblir Taq-polymeras go-to-enzymet för molekylärbiologer.

1 Ishino S, Ishino Y. 2014. Gränser i mikrobiologi 5: 465.

2 Coleman WB, Tsongalis GJ. 2017. Diagnostisk Molekylär patologi: en Guide till tillämpad Molekylär testning.

3 Williams M. 2018. Vetenskap

4 McInerney, Adams P, Hadi MZ. 2014. Molecular Biology International 287430.