I. U. B.: 2.7.7.7
C. A. S.: 9012-90-2
enzymatiska reaktioner: (bilder öppnas i ett nytt fönster)

• polymerisering
• korrekturläsning
• Primeravlägsnande

DNA-polymeras jag deltar i DNA-replikationen av prokaryoter. DNA-kedjans tillväxt är i 5′ till 3′ – riktningen med tillsats vid 3 ’ hydroxyländen. Den nya kedjan är basparad med mallen, och den nya kedjan och mallen är antiparallella. DNA-polymeras I är det vanligaste polymeraset och fungerar för att fylla luckor i DNA som uppstår under DNA-replikation, reparation och rekombination.

historia:

DNA-polymeras jag upptäcktes av Arthur Kornberg et al. 1956. Hans första resultat presenterades först vid 1956 års möte i Federation of American Societies for Experimental Biology (FASEB) i Atlantic City, New Jersey. Granskare av hans första papper föreslog att författarna hänvisar till produkten som ’polydeoxiribonukleotid’ snarare än ’DNA’; DNA godkändes först efter ett överklagande till chefredaktören John Edsall (Friedberg 2006). Ytterligare två artiklar publicerades 1958 av Lehman et al. och Bessman et al., vilket definitivt etablerade DNA-polymeras utförde DNA-replikation. Kornberg tilldelades Nobelpriset 1959 för sin upptäckt av DNA-polymeras I.

1969, Jovin et al. klargjorde aminosyrakompositionen (Jovin et al. 1969a, b). Samma år, DeLucia och Cairns isolerade en E. coli-stam med en mutation som påverkade DNA-polymeraset och överraskande fann att mutanten syntetiserade DNA normalt. Denna upptäckt tvivlar på DNA-polymerasens roll i replikering och ledde grupper att söka efter andra replikationsenzymer. Samtidigt visade Klenow och kollegor att behandlingen av DNA-polymeras med det proteolytiska enzymet subtilisin (Typ Carlsberg) resulterade i en ökning av polymerasaktivitet och minskning av exonukleasaktivitet. Det resulterande DNA-polymeraset isolerades och fick namnet ”Klenow-fragmentet” (Klenow och Henningsen 1970a, och Klenow och Overgaard-Hansen 1970).

1970 isolerades DNA-polymeras II av E. coli och kännetecknades av Arthur Kornbergs son, Thomas Kornberg (Kornberg och Gefter 1970). DNA-polymeras II rapporterades också oberoende av Knippers och av Moses och Richardson 1970 (Moses och Richardson 1970b). Ett år senare identifierade Thomas Kornberg och Gefter DNA-polymeras III (Kornberg och Gefter 1971).

det senaste arbetet med DNA-polymeras i har inkluderat att undersöka den molekylära grunden för substratspecificitet genom termodynamiska studier (Wowor et al. 2010) och single-molecule FRET experiment (Santoso et al. 2010). Hastings et al. har undersökt interaktionerna mellan de fem E. coli DNA-polymeraserna under cellulär stress (Hastings et al. 2010), och Kukreti et al.s studier har syftat till att bestämma vilka rester som är viktiga för 3′ -5 ’ exonukleasaktivitet (Kukreti et al. 2008).

specificitet:

DNA-syntes kräver en primersträng med en fri 3 ’ – hydroxylterminal glödgad till en DNA-Mallsträng och deoxynukleotidtrifosfater bildar baspar med mallen. Tillägg är i 5’ till 3 ’ riktning med frisättning av pyrofosfat. Enzymet är aktivt med DNA som innehåller enkelsträngade luckor och även med DNA med enkelsträngade raster eller nicks. Under vissa förhållanden kan RNA-DNA-hybrider och en RNA-duplex fungera som mallprimer (Setlow 1972).

5′ till 3′ exonukleasaktiviteten associerad med DNA-polymeras I bryter ned både enkel-och dubbelsträngat DNA i 5′ till 3′ – riktningen, vilket ger 5′ – mononukleotider. Exonukleasaktiviteten 5′ till 3′ är specifik för dubbelsträngat DNA, vilket ger 5′-mononukleotider och oligonukleotider. DNA-polymeras i kan också punktskatter felaktiga regioner i DNA (Setlow 1972).

den liknande strukturen hos DNA-polymeraser har indikerat att de flesta DNA-polymerasenzymer använder en identisk två metalljonkatalyserad polymerasmekanism. En metalljon aktiverar primerns 3 ’ – OH för attack på dNTP: s a-fosfat. Den andra metalljonen stabiliserar den negativa laddningen av det lämnande syret och kelaterar B – och g-fosfaterna (Steitz 1999). Klenow-fragmentet är en proteolytisk produkt av E. coli DNA-polymeras i som behåller polymerisation och 3′ till 5′ exonukleasaktivitet, men har förlorat 5′ till 3’ exonukleasaktivitet.

sammansättning:

DNA-polymeras I är det dominerande polymeriserande enzymet som finns i E. coli. Den innehåller en enda disulfidbindning och en sulfhydrylgrupp (Jovin et al. 1969b). Fem distinkta DNA-polymeraser har isolerats från E. coli och har betecknats I, II, III, IV och V. DNA-polymeras i-funktioner för att fylla DNA-luckor som uppstår under DNA-replikation, reparation och rekombination. DNA-polymeras II fungerar också vid redigering och korrekturläsning huvudsakligen i den eftersläpande strängen (Kim et al. 1997, Wagner och Nohmi 2000). DNA-polymeras III är det huvudsakliga replikativa enzymet. DNA-polymeras IV och V har stora aktiva platser som möjliggör mer basfel och är därför mer felaktiga. De saknar också korrekturläsning-exonukleasunderenheter för att korrigera felaktiga företag (Nohmi 2006 och Hastings et al. 2010). DNA-polymeras V är närvarande vid signifikanta nivåer endast i SOS-inducerade celler och överuttryck begränsar DNA-syntesen (Marsh and Walker 1985).

domänformen för alla polymeraser vars strukturer är kända har beskrivits som en” höger hand ”med” tumme”,” palm ”och” finger ” domäner (Kohlstaedt et al. 1992). Palmregionen tros katalysera fosforylöverföringen, och fingerregionen tros interagera med det inkommande nukleosidtrifosfatet och mallbasen det är parat till. Tummen tros hjälpa till att placera DNA och translokation (Brautigam och Steitz 1998).

molekylära egenskaper:

genen som kodar för DNA-polymeras i (polA) innehåller cirka 3000 baspar och kodar för cirka 1000 aminosyrarester i en enkel polypeptidkedja. Även organismer separerade av en miljard år av evolution (som Deinococcus-Thermus genera och E. coli) har cirka 35% aminosyraidentitet och cirka 50% homologi (Patel et al. 2001).

Proteinanslutningsnummer: P00582

Molekylvikt:

• 109 kDa (Jovin et al. 1969a, b)
• Klenow fragment: 70 kDa (gelfiltrering, Klenow och Overgaard-Hansen 1970)

optimalt pH:

• maximal aktivitet erhålls vid pH 7,4 med kaliumfosfatbuffert för nativt DNA-eller poly dAT-mallprimersystem (Richardson et al. 1964)
• Klenow fragment: maximala aktiviteter erhålls vid 7,4 med fosfatbuffert och vid 8.4 Med Tris-HCl-buffert

isoelektrisk punkt:

• 5.40 (teoretisk)

Utrotningskoefficient:

aktivatorer:

• en divalent katjon krävs för aktivitet
• Mg2+ vid en koncentration av 7 mM ger optimal aktivitet under förhållandena i standardanalysen (Richardson et al. 1964)
• Mn2+ kan delvis uppfylla metalljonkravet
• enzymaktivitet påverkas också av koncentrationer av monovalenta katjoner såsom K+, Rb+, Cs+ och NH4 +

hämmare:

• Kanchanomycin, mitomycin, bleomycin, phleomycin, ananthramycin, plurmycin A (Tanaka et al. 1965), and neomycin (Lazarus and Kitron 1973)
• Actinomycin inhibits only when guanosine and cytosine nucleotides are present (Cohen and Yielding 1965)
• Dideoxynucleoside
• Arabinosyl nucleotide triphosphate
• Deoxyuridine-5’-triphosphate and analogues of uridine and deoxyuridine with 5’-hydroxy or amino substituents (Kornberg 1974)
• Chloroquine and some of its analogs (Cohen and Yilding 1965)

Applications:

• hög procentuell inkorporering av radioaktivitet för nicköversättningsanalyser
• standardreferensmaterial för studier av DNA-polymeraser
• tillverkning av alternerande sampolymerer såsom poly d(A-T) och homopolymerer såsom poly dG-poly dC
• Klenow fragment: DNA-sekvensering (Sanger et al. 1977), fyllning av 5 ’överhäng och borttagning av 3’ överhäng för att bilda trubbiga ändar (Sambrook 1989) och andra strängsyntes i mutagenes (Gubler 1987)