Testbeskrivning

MLH1 kodande exoner 1-16, msh2 kodande exoner 1-10 och PMS2 kodande exoner 1-15, och långt in i 5′ och 3′ ändarna av alla introner och oöversatta regioner analyseras genom sekvensering. Brutto deletion / dupliceringsanalys bestämmer genkopieringsnummer för alla kodande exoner av MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2 och kodande exon 9 av EPCAM. Inversionen av kodande exoner 1-7 av msh2-genen detekteras av NGS och bekräftas av PCR och agarosgelelektrofores. Kliniskt signifikanta introniska fynd utöver 5 baspar rapporteras alltid. Introniska varianter av okänd eller osannolik klinisk betydelse rapporteras inte utöver 5 baspar från skarvkorsningen. Genomisk deoxiribonukleinsyra (gDNA) isoleras från patientens prov med hjälp av standardiserad metodik och kvantifieras. Sekvensanrikning av de riktade kodande exonerna och intilliggande introniska nukleotider utförs av en bete-infångningsmetodik med användning av långa biotinylerade oligonukleotidprober följt av polymeraskedjereaktion (PCR) och nästa generations sekvensering (NGS). Sanger-sekvensering utförs för alla regioner som saknas eller med otillräcklig läsdjupstäckning för pålitlig heterozygot variantdetektering. Potentiellt homozygota varianter, varianter i regioner komplicerade av pseudogeninterferens och variantanrop som inte uppfyller täckningsdjupet och variantallelfrekvenskvalitetströsklar verifieras genom Sanger-sekvensering. Brutto deletion / dupliceringsanalys av MLH1, MSH2, MSH6 och PMS2 med läsdjup från NGS-data och EPCAM med multiplex ligationsberoende sondförstärkning (MLPA) utförs också. Alla kopieringsnummerändringar som upptäcks av NGS bekräftas av målinriktad kromosomal mikroarray och/eller MLPA. Om en deletion detekteras i exons 13, 14 eller 15 av PMS2, dubbelsträngad sekvensering av lämpliga exon(er) av pseudogen, PMS2CL, kommer att utföras för att avgöra om deletionen finns i pms2-genen eller pseudogen. Om en radering upptäcks i exon 9 av EPCAM, kommer radering/dupliceringsanalys av kodande exons 3 och 8 av EPCAM att utföras. För EPCAM rapporteras endast brutto deletioner som omfattar 3 ’ – änden av genen.